[发明专利]一种γ-PGA聚合酶基因重组菌株及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种γ‑PGA聚合酶基因重组菌株及其构建方法与应用，是一种从糖质原料一步法发酵合成γ–聚谷氨酸的生产工艺，属于合成生物学和发酵工程领域。本发明将天然生产菌地衣芽孢杆菌的γ‑聚谷氨酸合成酶的基因簇capBCA克隆至一株高产谷氨酸的谷氨酸棒杆菌F343中进行外源表达，在此基础上，利用不同强度的RBS调控元件调控合成酶基因簇各基因的表达水平获得的重组菌株Cg 1/10BCA、Cg B1/10CA和Cg BC1/10A所生产的γ‑PGA分子量为295.47～28018kDa。本发明成功地构建了聚谷氨酸的外源合成途径，实现理性控制γ‑PGA分子量的目的，节省了原料和过程控制成本，提高了经济效益，拓展了聚谷氨酸的应用范围，具有很好的工业应用价值和前景。

技术领域

本发明涉及应用合成生物学技术，具体是一种γ-PGA聚合酶基因重组菌株及其构建方法与应用技术，通过调节γ-聚谷氨酸合成酶调节其分子量，属于合成生物学和发酵工程领域。

背景技术

γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是一种由L-谷氨酸和D-谷氨酸单体聚合成的生物聚合物，具有水溶性高、良好的生物降解特性、较强的增稠能力等性质，对重金属离子具有优异的吸收性和结合能力。近年来，γ-PGA广泛应用于食品、化妆品、生物医学、环境保护等领域。聚谷氨酸分子量是限制其应用的一个重要因素，例如用于水处理领域的聚谷氨酸分子量需要在150-200kDa左右，而化妆品领域需要80-120kDa左右的聚谷氨酸，医药载体领域则需要低分子量聚谷氨酸，例如，分子量30-60kDa的聚谷氨酸可以用于合成水溶性γ-PGA-紫杉醇偶联物抗肿瘤，11kDa大小的γ-PGA可以促进钙吸收。目前，主要有物理、化学、酶法降解等方法控制其分子量。物理法操作过程简单，但效率较低，产品稳定性较差，化学法引入化学试剂，造成污染，反应条件复杂，产生大量工业废水，而酶解法利用γ-PGA降解酶酶解，步骤繁琐，也不是控制γ-PGA分子量大小的高效方法。

为解决上述问题，相关研究以B.subtilis 168为底盘微生物，异源表达不同来源的γ-PGA合成酶基因，通过微生物发酵法直接合成得到了一定分子量范围的聚谷氨酸。但是其仍然不能达到精确控制γ-PGA分子量，以满足不同应用需求。

发明内容

本发明要解决的技术问题是在谷氨酸棒杆菌中合成不同分子量的γ-聚谷氨酸。本发明选用高产L-谷氨酸的工业菌株----谷氨酸棒杆菌F343菌株为底盘微生物，应用合成生物学技术，对地衣芽孢杆菌的γ-聚谷氨酸合成酶基因capBCA表达水平单独调控并串联，在Corynebacterium glutamicum F343菌株中成功表达，成功构建了重组菌株Cg 1/10BCA、Cg B1/10CA和Cg BC1/10A，获得不同产量且不同分子量的γ-聚谷氨酸。

本发明的第一个目的是γ-聚谷氨酸合成酶基因capBCA表达水平单独调控并串联，先提取地衣芽孢杆菌基因组，通过PCR分别扩增出γ-聚谷氨酸合成酶基因capB、capC、capA，选取2种强度的基因调控元件，分别单独调控聚合酶基因capB、capC、capA，再通过同尾酶技术得到串联表达重组质粒，转化到感受态细胞C.glutamicum F343中，最终构建了单独调控聚合酶基因重组菌株。

进一步的，所述γ-聚谷氨酸合成酶基因，在本发明的一种实施方式中，来自于地衣芽孢杆菌，从ATCC购买，菌株号为ATCC 9945a。

进一步的，所述的基因调控元件，在本发明的一种实施方式中，是双顺反子结构标准化的RBS，即BCD-RBS。

进一步的，所述的2种强度，在本发明的一种实施方式中，是低强度BCD-RBS1和高强度BCD-RBS10。

进一步的，所述同尾酶连接技术，在本发明的一种实施方式中，是一种直接用于路径的新型模块化合成生物学工具ePathBrick。