[发明专利]一种表观遗传学药物凋亡诱导模型的构建方法

说明书

本发明涉及表观遗传学技术领域，尤其指一种表观遗传学药物凋亡诱导模型的构建方法，选取表观遗传学相关肿瘤细胞，采用细胞培养液进行体外培养，添加梯度浓度的表观遗传学药物后培养；更换无表观遗传学药物细胞培养液，继续放入37℃二氧化碳培养箱中培养，提取DNA进行琼脂糖凝胶电泳，采用透射电镜进行细胞形态观察，采用流式细胞仪进行细胞生长周期检测。本发明采用肿瘤细胞体外培养的方式，在培养液中添加梯度浓度的表观遗传学药物进行处理，并通过DNA琼脂糖凝胶电泳、透射电镜进行细胞形态观察和流式细胞仪检测细胞生长周期，来建立表观遗传学药物凋亡诱导模型，操作简单、结果准确，有利于指导表观遗传学药物在肿瘤治疗中的应用。

技术领域

本发明涉及表观遗传学技术领域，尤其指一种表观遗传学药物凋亡诱导模型的构建方法。

背景技术

表观遗传学修饰与肿瘤的发生发展密切相关，其主要通过DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA调控和染色质结构重构等方式对基因功能和表达水平进行调控，从而影响肿瘤的进展。目前针对表观遗传学的药物已经逐渐应用于恶性肿瘤的治疗，常见的药物类型包括DNA 甲基转移酶抑制剂和组蛋白去乙酰化酶抑制剂，但此类药物仍存在诸多不足之处广泛的临床应用仍需要进一步的研究，令人鼓舞的是表观遗传药物与多种抗肿瘤药物联合应用已表现出巨大的应用潜力。表观遗传学的主要研究内容包括：DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA 调控和染色质结构重构。表观遗传的修饰在不改变DNA序列的同时能调控基因的表达和(或)转录从而影响胚胎发育、干细胞的分化、衰老和肿瘤发生等过程。

DNA甲基化是指在甲基转移酶(DNMT1、DNMT3A和DNMT3B)的催化下，将S腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)提供的甲基转移到胞嘧啶5位的碳原子，形成5′甲基胞嘧啶。DNMT1主要是维持DNA甲基化，通过DNA复制将亲代甲基化DNA遗传到子代DNA。 DNMT3A和DNMT3B能将未甲基化的CpG位点甲基化，这在胚胎发育和肿瘤发生中起着重要作用。DNMT2是一种tRNA甲基转移酶，而DNMT3L 是在胚胎发育过程中协调DNMT3A和DNMT3B的结构蛋白[10]。DNMT3C 最近由Barau等发现，主要涉及雄性生殖细胞系的反转录转座子启动子的甲基化。肿瘤特异性甲基化的基因能在循环肿瘤细胞 (circulating tumor cells,CTCs)、血液、尿液及其他体液中被检测，因此常用于早期肿瘤的诊断和预后的研究。在结肠、前列腺、乳腺、肝脏肿瘤和白血病中也发现DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L的含量常常升高。研究表明DNMT3A的缺乏会引起部分基因的低甲基化并抑制白血病的转化，但也有证据表明DNMT3A和DNMT3B是抑制淋巴系统恶性肿瘤的肿瘤抑制基因。

组蛋白是由H1、H3、H2A、H2B和H4这5种类型的核心蛋白组成的高度保守的蛋白质，并与DNA共同构成核小体。组蛋白氨基末端会在翻译后被修饰，组蛋白修饰后的类型和DNA甲基化的程度将会决定特定的染色质结构。组蛋白修饰包括磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化、糖基化、ADP核糖基化、去氨基化、类泛素化和脯氨酸异构化等。组蛋白尾部残端不同的修饰类型与特定蛋白相互作用，从而将染色质分为异染色质和常染色质。组蛋白修饰不仅可逆性抑制或促进基因转录而且还可以影响DNA修复、复制、干细胞形成和细胞状态变化等过程。

与肿瘤的遗传因素相比，可逆的表观遗传变异可以通过化学药物调节，在癌症治疗中具有广泛的前景。目前针对表观遗传学的药物正在逐步被开发并用于肿瘤的治疗。主要包括：DNA甲基转移酶抑制剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂和联合用药。

DNA甲基转移酶抑制剂(DNA methyltransferase inhibitors, DNMTis)通过抑制DNMTs的活性来促进抑癌基因的表达从而减少肿瘤细胞的产生，所以DNMTs可以作为特异性抗肿瘤药物的有效靶点，其主要包括核苷类和非核苷类。核苷类抑制剂主要包括azacitidine (AZA)和decitabine。非核苷类DNMT抑制剂：非核苷类DNMT抑制剂在白血病，前列腺和乳腺癌中表现出良好的抗肿瘤作用