[发明专利]基于RPA和CRISPR技术的快速新冠病毒检测仪

说明书

本发明公开了一种基于RPA和CRISPR技术的快速新冠病毒检测仪，包括生物检测模块、光电探测模块以及报警显示模块，系统将新冠病毒RNA样本采集、核酸提取、扩增、荧光检测四步合一，选用唾液作为检测样本使得采集更便捷，采用无需纯化的RNA快速提取方法，利用RPA技术可在常温进行缩短扩增时间，基于CRISPR的荧光检测使得基因序列的检测灵敏度提升，采用共聚焦光路、LED光源、光电倍增管，利用微弱光放大电路将微弱荧光信号放大并减弱噪声，最后用LED亮灯进行检测阳性的报警，取消显示屏实时监测显示，使得整个装置结构简单，对温度要求低，成本低，灵敏度高，机器小便于携带，检测时间短，仅需约1h。

技术领域

本发明属于生物医学光电检测技术领域，具体涉及一种基于RPA和CRISPR 技术的快速新冠病毒检测仪。

背景技术

RPA技术即重组酶聚合酶扩增，RPA主要分为4个步骤：第一步，重组蛋 白酶在辅助因子uvs Y的协助下与上下游引物形成酶-引物复合体；第二步，复 合物在模板上定位后直接启动链交换反应，形成D状环；第三步，重组酶uvs X 解离后引物的3′端暴露，被链置换DNA聚合酶识别进行链延伸，形成新的互补 链；第四步，在链置换DNA聚合酶系的协同作用下，开始特异性片段的扩增， 30min内就可以将靶序列扩增到10～12数量级，达到检测水平；该反应最适温 度在37～42℃，低成本、耗时短，整个过程在10～30min内即可完成，可实现核 酸的快速检测。

与其他等温方法相比，RPA对抑制剂具有更大的耐受性，可用于更复杂的 样品，RPA引物探针设计较为简单，其荧光检测反应体系只需一对引物和一条 探针即可实现对目标基因的扩增并对整个扩增过程实时监控。此外RPA技术除 缓冲液及Mg2+外，其余体系组分均以干粉状态保存于反应管中，稳定且易于保 存，在封闭的反应体系中也减少了污染的可能性，RPA技术被认为有望取代PCR 的核酸检测技术。

CRISPR核酸检测技术的核心是一种叫做Cas13a的蛋白酶和与其结合的向 导RNA。根据新冠病毒的RNA序列，研究人员设计了能够靶向新冠病毒特异 性序列的向导RNA，它通过碱基对配对的方式，精准识别COVID-19中的RNA， 与此同时激活其上的Cas13a蛋白酶，Cas13a蛋白酶被激活后，会对周围的单链 RNA进行疯狂切割，当它切割可淬灭的荧光RNA，则以产生定量的荧光信号， 我们可以利用光电探测器探测试剂样品中是否发出荧光，来确定是否存在新冠 病毒。

当前的新冠肺炎呈现出一系列的临床症状，从轻度的流感症状到危及生命 的状况，在感染者早期进行快速且有效的检测以从其他疾病中识别出COVID-19 患者非常重要。遏制住疫情的重要方法是找到已感染人群、及时隔离，切断感 染源，目前的常用检测方法是核酸检测，相较于温度判断的不准确性、CT检测 的危害性、抗体免疫检测的滞后性，核酸检测更有效、安全、及时。

目前市场上的核酸检测方法及其优缺点如下：

(1)实时荧光定量PCR检测仪，现在市场上最常用的核酸检测是逆转录酶 聚合酶链式反应RT-PCR检测，需要经历咽拭子采集、RNA提取、扩增、荧光 检测四步，在咽拭子采集过程中对采集人员有严格的防护要求，RNA的提取和 扩增容易出现样本污染，步骤复杂，需要温度升高降低的反复循环，并且市场 上一台实时荧光定量PCR检测仪的价格超过了20万元，非常昂贵，检测的时间 在4～6小时，耗时长。

(2)雅培(Abbott)公司上市了一款运用等温扩增技术的称为ID NOW的快 速检测平台，阳性检测只需5min，阴性检测只需13min，但这并不包括咽拭子 的采集、RNA的提取步骤，且其检测的准确性并没有得到证实。

(3)来自加州大学旧金山分校及Mammoth Biosciences公司的研究人员开 发了一种基于CRISPR-Cas12分析技术的叫做SARS-CoV-2DETEDTR的检测方 法，仅需30min的侧向层析检测，可直接通过试纸可视化判断，更迅速直接， 但是咽拭子RNA的提取步骤仍需单独进行。

发明内容