[发明专利]一种环瓜氨酸肽双微球偶联物及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种环瓜氨酸肽双微球偶联物及其制备方法与应用，所述方法包括将羧基胶乳微球和氨基微球与环瓜氨酸肽连接，形成氨基微球‑环瓜氨酸肽‑羧基微球偶联物。本发明利用两个粒径接近的微球，先使用羧基微球，再使用氨基微球与CPP抗原进行偶联，以提升检测试剂的灵敏度，同时，可以保持较好的检测线性范围；本发明方法制备的试剂具有较好的稳定性，且试剂的制备工艺简单。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种环瓜氨酸肽双微球偶联物及其制备方法与应用。

背景技术

RA是最常见的关节炎症性疾病，发达国家成人的发病率是1～2％，病因不明，可发生在任何年龄，但常见35-55岁女性发病，RA属于慢性疾病，以阶段性发着与缓解交替为特征。

抗-CCP抗体被发现可用于类风湿关节炎的早期诊断，并对RA病人的关节侵害和放射学损伤具有一定的预测价值。抗CCP抗体可以在RA病人出现明显的关节损伤之前被检测出。一项前瞻性群组研究显示，在没有出现明显的RA临床症状的抗CCP阳性的病人中，约有93％的病人会发展成RA，表明该抗体有非常好的阳性预期值。

目前，测定抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体常用的方法有免疫层析法、ELISA法、化学发光法、胶乳免疫比浊法等。其中，免疫层析法检测速度快，但其准确度和重复性不佳；ELISA法操作繁琐，检测时间长；化学发光法检测的准确度和重复性好，但耗时而且价格昂贵，对设备的要求较高；胶乳免疫比浊法操作简单、使用方便，但现有的免疫比浊法检测试剂盒存在灵敏度和稳定性较差，线性范围比较窄的缺点。为提高灵敏度和线性，现多采用大粒径微球和小粒径微球混合的方法，但大微球的生产工艺比较难控制，其试剂稳定性也难于优化。也有采用增加CCP在微球的偶联量来实现灵敏度的提升，但由于空间位阻的影响，能够发挥作用的CCP的量是有限的，即使CCP的偶联量增加，但在微球表面的有效标记量未必有明显的改变甚至是更少了。

综上所述，现有检测方法中，其通过采用大粒径微球或者额外制备辅助偶联物提高灵敏度和线性。其存在着制备工艺繁琐、制备效率低、制造成本高的缺陷。

发明内容

为此，本发明提供一种环瓜氨酸肽双微球偶联物及其制备方法与应用。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种环瓜氨酸肽双微球偶联物的制备方法，所述方法包括将羧基胶乳微球和氨基微球与环瓜氨酸肽连接，形成氨基微球-环瓜氨酸肽-羧基微球偶联物。

本发明的一个实施例中，所述羧基微球与所述环瓜氨酸肽连接过程为：将活化后的羧基微球与0.05M MOPS缓冲液稀释的环瓜氨酸肽溶液混合均匀，室温搅拌0.5h，得到羧基微球与环瓜氨酸肽偶联物；其中，所述羧基微球为聚苯乙烯胶乳微球。

本发明的一个实施例中，所述聚苯乙烯胶乳微球的活化方法为：在20mL0.05M MES缓冲液中加入1mL直径为120nm的10％聚苯乙烯胶乳微球，再加入5mL浓度为1mg/mL碳化二亚胺水溶液，室温搅拌30min，得到活化后的聚苯乙烯胶乳微球。

本发明的一个实施例中，所述羧基微球与环瓜氨酸肽偶联物加入到氨基微球溶液中均匀混合，搅拌，得到含氨基微球-环瓜氨酸肽-羧基微球偶联物的溶液。

本发明的一个实施例中，所述氨基微球溶液是将0.5mL 10％的氨基胶乳微球加入到10mL 0.01％的BSA溶液混合形成。

本发明的一个实施例中，所述方法还包括：向所述含氨基微球-环瓜氨酸肽-羧基微球偶联物的溶液中加入2mL 5％BSA搅拌1h，进行封闭，得到含稳定的氨基微球-环瓜氨酸肽-羧基微球偶联物的溶液。

本发明的一个实施例中，将所述含稳定的氨基微球-环瓜氨酸肽-羧基微球偶联物的溶液用pH8.0的MOPS缓冲液洗涤，离心，弃去上清，得到氨基微球-环瓜氨酸肽-羧基微球偶联物。