[发明专利]一种犬角膜上皮细胞永生化细胞系的构建方法和应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种犬角膜上皮细胞永生化细胞系的构建方法和应用，包括以下步骤：将实验犬麻醉后，采集角膜组织，收集角膜上皮组织，进行上皮细胞原代培养；将纯化后的原代犬角膜上皮细胞进行携带SV40T抗原基因的病毒转染，通过单克隆获得永生化犬角膜上皮细胞。本发明方法建立的细胞易于培养，增殖快，且具有血清依赖性，无肿瘤变，有利于进行角膜相关疾病致病机理、药物开发和疾病防治的体外研究，提供基础材料制备方法。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种犬角膜上皮细胞永生化细胞系的构建方法和应用。

背景技术

犬作为最常见的伴侣动物，近年来其饲养数目不断提升。由于犬生性好动，加之眼部解剖结构的特殊性，由外伤、真菌、细菌、病毒等原因造成的角膜疾病成为常见的眼科疾病。角膜上皮细胞层作为角膜的最外层，能参与先天性免疫反应，能感应病原体存在并发出信号从而激活角膜防御系统。角膜上皮细胞的体外培养对研究角膜的生理学、病理学、免疫学以及分子生物学等都是极为重要的手段，常用于研究细胞代谢产物、病原感染、各种生长因子和药物对细胞生长的影响。体外培养的原代犬角膜上皮细胞(canine cornealepithelial cells，cCEpi)，容易衰老，传代次数有限，且活体采样需要动物数量较多，降低了动物福利，且难以满足体外研究需求。SV40T抗原被随机整合到宿主基因组，表达后的SV40T抗原可导致细胞永生化，是目前建立永生化细胞系的常用方法之一。本技术方法通过转染SV40T成功建立犬角膜上皮细胞的永生化细胞系(Immortalized canine cornealepithelial cells,cCEpi-SV40T)，在连续传代后能稳定表达细胞的生物学特性，未见衰老，且具有血清依赖性，无瘤化特征，可以作为犬角膜疾病研究或者药物筛选等体外研究使用，减少动物使用，提高动物福利。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种犬角膜上皮细胞永生化细胞系的构建方法和应用，该方法建立的细胞易于培养，增殖快，且具有血清依赖性，无肿瘤变，有利于进行角膜相关疾病致病机理、药物开发和疾病防治的体外研究。

为达到上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种犬角膜上皮细胞永生化细胞系的构建方法，包括以下步骤：

将实验犬麻醉后采集角膜组织，收集角膜上皮组织，进行上皮细胞原代培养；

将纯化后的原代犬角膜上皮细胞进行携带SV40T抗原基因的病毒转染，通过单克隆获得永生化犬角膜上皮细胞。

进一步的，将永生化犬角膜上皮细胞接种细菌，检测IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和TLR2的mRNA表达量；引物序列如下：

进一步的，检测方法如下：将荧光定量反应体系Ⅰ和Ⅱ混合于96孔板中，盖上封口膜后于4℃瞬离。离心后放入荧光定量PCR仪中反应，反应条件为：95℃反应30s预变性→95℃持续10s→60℃持续30s进行40个循环反应；

GAPDH、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和TLR2的基因在其反应物的荧光信号到达阈值时的循环次数为Ct值；基因表达量采用相对定量的方法计算，GAPDH作为内参基因；采用2^-ΔΔCT法对各个的Ct值进行分析，基因相对表达量的计算公式为2^-ΔΔCt；

其中ΔΔCt＝(待测样品目的基因平均Ct值-待测样品GAPDH平均Ct值)-(对照样品目的基因平均Ct值-对照样品GAPDH平均Ct值)；

荧光定量PCR反应体系Ⅰ：

荧光定量PCR反应体系Ⅱ：