[发明专利]猪盖塔病毒感染性克隆及其建构方法及应用

权利要求书

1.一种猪盖塔病毒HuN1株感染性克隆，其特征在于，所述猪盖塔病毒HuN1株感染性克隆包含如SEQ ID NO:2所示的序列。

2.根据权利要求1所述的猪盖塔病毒HuN1株感染性克隆的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

HuN1株GETV基因组全序列扩增：将全长基因分为4段扩增，分别设计上、下游引物，并加入保护性碱基；将各组分加入PCR管，混匀瞬离后放入PCR仪中进行扩增；

重组质粒的构建：将扩增的片段克隆至T载体中，并且通过Overlap PCR，在基因组5’端引入CMV启动子及其增强子序列；将酶切的基因片段和pACYC-177载体片段切胶回收并连接，转化至Stbl3感受态细胞，挑取单个菌落接种于含有Kan的LB液体培养基中过夜培养；得到病毒全长基因组感染性克隆pAC-GETV，其中pACYC-177预先插入酶切位点：合成含有限制性核酸内切酶酶切位点的小片段stuffer，其序列为CTCTTAGGATCCTACCTAGAATTCAGTAGTCTTAAGCTAGCAAGATCTATCACTACGCGTACTCAGCTGCAGTACTAG；所述的酶切位点为BamHI、EcoRI、AflII、BglII、MluI、PstI；将pACYC-177质粒和stuffer使用BamHI+PstI双酶切，纯化片段连接过夜，转化至感受态细胞Stbl3，分离单菌落，提取质粒；用于安插GETV基因片段；

重组病毒的拯救：将测序正确的感染性克隆质粒转染至BHK-21细胞，培养获得GETV拯救病毒；

含外源基因的感染性克隆构建：分别扩增EGFP片段及其插入位点附近的片段E1、E2、E3，通过Overlap PCR连接，获得片段E，ApaI+MluI双酶切连接至pAC-GETV。

3.根据权利要求2所述的猪盖塔病毒HuN1株感染性克隆的构建方法，其特征在于，采用下列引物：

4.权利要求1所述的猪盖塔病毒HuN1株感染性克隆在制备猪盖塔病毒诊断试剂和/或疫苗中的应用。