[发明专利]利用基因组编辑技术构建鳞翅目昆虫雌性不育品系的方法

说明书

本发明公开了利用基因组编辑技术构建鳞翅目昆虫雌性不育品系的方法。该方法包括：1)构建Esp基因敲除核酸构建物，其包括从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：U6启动子，第一Esp基因靶点和polyA；U6启动子，第二Esp基因靶点和polyA；2)将所述构建物和可表达Piggybac转座酶的PHA3PIG质粒共转鳞翅目新鲜昆虫卵，得G0代，自交得G1代；和，3)将所述G1代与表达Cas9蛋白的转基因鳞翅目昆虫交配得G2代，即得。本发明利用基于piggyBac转座子的CRISPR/Cas9技术成功构建了在不影响正常交配行为的前提下雌性不育的鳞翅目昆虫，在鳞翅目害虫通过雌性不育技术进行防治方面具有重要的价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及利用基因组编辑技术构建鳞翅目昆虫雌性不育品系的方法。

背景技术

家蚕是以桑叶为食料、吐丝结茧的经济昆虫，也是鳞翅目的模式昆虫。家蚕除了具有模式生物的基本要素外，还有自身的特殊优势，例如基础研究历史悠久、多重测序数据和已实现人为控制等。利用家蚕作为昆虫害虫防治特别是鳞翅目害虫的遗传防治的研究对象，将在农林业害虫遗传防治方面产生重大的影响，而且还将在鳞翅目其他昆虫中推广应用。现阶段害虫的生物学防治不育技术大多是使用辐射及四环素诱导，而这两种不育技术耗时耗力并不能有稳定的遗传效应品系。因此，研究一种稳定遗传以及下一代雌性有效不育的品系迫在眉睫。

昆虫不育技术的原理是将突变后的不育昆虫规模性的释放到田间并与野生型异性昆虫交配，使其无法正常产生后代，以期达到降低甚至根除靶标害虫的目标。昆虫不育技术已被认为是一种环境友好型的害虫生物防治新方法，其不仅可以实现控制害虫种群数量的目的，而且对其它物种和环境没有影响。在过去的六十年中，研究者们主要开发了三种不同类型的昆虫不育技术，包括：基于辐射的昆虫不育技术(radiationbased steriletechnology，rSIT)、微生物介导的昆虫不育技术(microbe-mediated steriletechnology，mSIT)和基于遗传操作的昆虫不育技术(genetic-based inheritablesterile technology， gSIT)。现在被广泛应用的不育技术是gSIT，其原理是通过将外源或内源基因插入宿主基因组或将内源基因定点敲除，使昆虫性别特异性致死或不育，并成功实现种群数量控制。

昆虫不育技术有效实施的重要因素是改造后的个体在自然界有较强竞争能力和具有多代效应。转基因不育昆虫通过携带不育性状，并能正常释放信息素吸引野生型异性进行交配，后代中的单一性别突变体可以与野生型异性交配产生后代，而另一性别突变体可以与野生型异性交配但不产生后代，不育性状可以继续在后代中广泛传播，并在一定时间内最终导致种群数量减少。在昆虫交配生殖过程中，雌性卵黄发生的相关基因是雌性生殖成功必不可少的。卵黄发生基因能够影响卵黄蛋白的沉积，进而影响雌性的生殖力、生育力及后代存活率等。

发明内容

本发明的目的是鳞翅目昆虫遗传不育技术中缺乏雌性不育的鳞翅目昆虫品系的不足，提供利用基因组编辑技术构建鳞翅目昆虫雌性不育品系的方法。

为此，本发明提供一种制备雌性不育的鳞翅目昆虫的方法，其包括以下步骤：

1)构建Esp基因敲除核酸构建物，其包括从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：第一sgRNA表达元件和第二sgRNA表达元件；所述的第一 sgRNA表达元件包括从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：U6启动子，第一Esp基因靶点和polyA；所述的第二sgRNA表达元件包括从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：U6启动子，第二Esp基因靶点和polyA；

2)将步骤1)所述的Esp基因敲除核酸构建物和可表达Piggybac转座酶的PHA3PIG质粒共转鳞翅目新鲜昆虫卵，孵化，化蛾，得G0代，使G0 代自交，获得G1代；和

3)将步骤2)所述的G1代与表达Cas9蛋白的转基因鳞翅目昆虫交配，获得的G2代，即得雌性高度不育的鳞翅目昆虫。