[发明专利]一种高效敲除NK细胞中TIGIT基因的方法

权利要求书

1.一种非治疗目的高效敲除NK细胞中TIGIT基因的方法，所述方法是利用CRISPR/Cas9基因编辑系统，以电穿孔转染方式将sgRNA与Cas9蛋白的复合物导入经扩增的NK细胞中，其特征在于：sgRNA的序列选自SEQ ID NO.1或2所示序列，且，所述sgRNA经过磷酸化修饰，进行磷酸化修饰的位点为3'端和5'端各3个硫代基和甲氧基。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述复合物中，sgRNA与Cas9蛋白的质量比为1:(3～5)。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述Cas9蛋白先经过大肠杆菌密码子优化，然后构建到Pet28a表达质粒骨架中。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述Cas9蛋白具有SEQ ID NO.5所示序列。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述sgRNA的制备包括如下步骤：

a)退火，向每条sgRNA添加TAGG内切酶粘性末端上游序列及AAAC内切酶粘性末端的下游序列后一起进行退火处理；

b)线性化，将pUC57-sgRNA表达载体经过BsaI线性化；

c)连接，将退火产物连接到经过BsaI线性化的pUC57-sgRNA表达载体上，连接的载体通过转化、挑菌和鉴定后，对阳性克隆摇菌提取质粒并测定浓度；

d)PCR扩增，所用正向引物的序列为：TCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGG，所用反向引物的序列为：AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTC；

e)体外转录，利用T7转录试剂盒将sgRNA的DNA体外转录为RNA，凝胶电泳鉴定后用RNA回收。