[发明专利]一种猪病原或外源性蛋白特异性抗原肽筛选和鉴定的方法

权利要求书

1.一种利用猪源APCs在猪种属上对病原或外源性蛋白进行特异性抗原肽筛选鉴定的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，猪源APCs细胞的制备；

步骤二，抗原肽的质谱鉴定；

步骤三，基于NanoLuc融合蛋白的抗原肽的ELISA验证。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述猪源APCs细胞的制备采用如下方法：（1）猪骨髓源树突状细胞，通过分离仔猪的长腿骨，开孔后使用细胞培养液冲洗骨髓腔，获得的骨髓细胞经过猪粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子（GM-CSF）的诱导后经体外培养7天后获得；（2）猪肺泡巨噬细胞，通过冲洗猪肺脏后，将肺泡灌洗液离心后获得；（3）猪外周血单核细胞源巨噬细胞，收集猪抗凝血，通过使用淋巴细胞分离液，从抗凝血中获得猪外周血单核细胞，加入猪粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子（GM-CSF）和猪白介素4（IL-4）体外诱导培养7天后获得；或者（4）使用外来免疫原（包括并不限于病原，疫苗，蛋白抗原等）免疫猪个体，其后，分离猪的脾脏，淋巴结，经过体外在单细胞滤网上研磨获得包含有猪内源性巨噬细胞的免疫细胞群；

和/或

所述的抗原肽的质谱鉴定的方法包括如下步骤：（1）制备富集“SLA-DR-抗原肽”复合物；（2）获得抗原肽氨基酸序列；（3）使用质谱仪测定抗原肽的分子量，并通过质谱分析软件搜索病原来源蛋白氨基酸数据库的方式以确定抗原肽氨基酸序列；

和/或

所述的基于NanoLuc融合蛋白的抗原肽的ELISA验证的方法包括如下步骤：（1）将所获的抗原肽依照其cDNA序列人工合成克隆进入pET28-NanoLucC1载体，表达为NanoLuc融合抗原肽，并使用NanoLuc抗体检测融合；（2），分别将NanoLuc融合抗原肽作为包板抗原，通过ELISA检测相应病原感染猪血清样本，ELISA检测为阳性的肽段即为有效的抗原肽，否则不是有效的抗原肽。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述制备富集“SLA-DR-抗原肽”复合物的方法为：使用APCs经过免疫原刺激（如病毒感染，加入抗原和APCs共培养等方式），再使用细胞裂解缓冲液裂解APCs制备细胞裂解液，使用识别SLA-DR的抗体从全细胞裂解液中富集“SLA-DR-抗原肽”复合物；

和/或

所述获得抗原肽氨基酸片段的方法为：将富集“SLA-DR-抗原肽”复合物使用三氟乙酸缓冲液处理，从SLA-DR上分离洗脱抗原肽，再使用截留分子量为5kD的超滤管，去除残留抗体及SLA-DR分子单体，使滤过液中仅含有抗原肽，再通过脱盐处理后，即得到所述抗原肽氨基酸片段。

4.权利要求1-3中任一项所获得的抗原肽在制备疫苗中的应用，优选的，所述疫苗为基因工程重组疫苗，优选的，所述基因工程重组疫苗采用如下方法制备得到：将质谱技术所测定的来源于免疫原的“抗原肽”，依据抗原肽的数量，将其氨基酸编码序列进行串联或单独表达，通过体外重组蛋白表达系统（大肠杆菌，酵母，昆虫细胞，哺乳动物细胞等）进行重组表达，所表达获得的重组蛋白，即为相应免疫原的“抗原肽基因工程重组疫苗”。