[发明专利]一种CAR-T细胞的复苏方法

说明书

本发明公开一种CAR‑T细胞的复苏方法，包括以下步骤：液氮中取出装有CAR‑T细胞及冻存液的冻存袋，加入36～40℃预热的复苏液，冻存袋于36～40℃水浴条件下1～2min摇晃化冻，离心，弃上清；加入36～40℃预热的复苏液混合，离心，弃上清，用细胞培养基重悬细胞；所述复苏液包括以下成分：L‑脯氨酸10～50μg/L、亚硒酸钠10‑100mg/L、丙酮酸钠2.0～2.2mg/L、NaOH 0.2～0.5mg/L、氯化镁0.2～0.4mg/L、黄芪甲苷15～25mg/L、白术内酯Ⅱ10～50mg/L、泛影酸钠15～30mg/L，余量是细胞培养基。采用本发明复苏方法，能够很好的保持细胞的活率、增殖能力和清除肿瘤细胞的能力。且该法操作简便，成本较低，利于产业化使用。

技术领域

本发明涉及CAR-T细胞技术领域，具体涉及一种CAR-T细胞的复苏方法。

背景技术

CAR-T细胞是将人工设计的外源性嵌合抗原受体(CAR)导入到T细胞内后得到的一种改造过的T细胞。CAR-T细胞因在白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、脑胶质瘤等恶性肿瘤治疗中表现出良好的治疗效果而备受关注。在CAR-T细胞的应用过程中，由于细胞制剂制备周期、治疗时机等因素的影响，常常需要对其进行液氮冻存，使用时对其进行复苏。对冻存细胞复苏时，通常是将冻存管或冻存袋直接置于37℃迅速解冻，再加入完全生长培养基重悬细胞，离心后弃去上清，加入培养基继续培养。本研究前期对CAR-T细胞的冻存方法进行改良，使用由泊洛沙姆、西兰花多糖、瓜儿豆蛋白等成分构成的冻存液进行冻存。泊洛沙姆、西兰花多糖、瓜儿豆蛋白等形成的网络结构，具有良好的CAR-T细胞保护作用，避免CAR-T细胞在液氮长期冻存过程中被损伤。但研究过程中发现，使用该冻存液后，若采用常规的复苏方法，仍然不能使冻存后的细胞达到最佳的增殖能力和清除肿瘤细胞的能力。鉴于此，有必要对CAR-T细胞的复苏方法进一步进行改良。

发明内容

为进一步提高CAR-T细胞复苏后的增殖能力和清除肿瘤细胞的能力，本发明提供一种改良后的CAR-T细胞复苏方法。

本发明方案包括以下方面：

一种CAR-T细胞的复苏方法，包括以下步骤：

液氮中取出装有CAR-T细胞及冻存液的冻存袋，加入36～40℃预热的复苏液，冻存袋于36～40℃水浴条件下1～2min摇晃化冻，离心，弃上清；加入36～40℃预热的复苏液混合，离心，弃上清，用细胞培养基重悬细胞；

所述复苏液包括以下成分：L-脯氨酸10～50μg/L、亚硒酸钠10～100mg/L、丙酮酸钠2.0～2.2mg/L、NaOH 0.2～0.5mg/L、氯化镁0.2～0.4mg/L、黄芪甲苷15～25mg/L、白术内酯Ⅱ10～50mg/L、泛影酸钠15～30mg/L，余量是细胞培养基。

优选的，两次复苏液的加入量均为细胞冻存液的2～3倍体积。

优选的，离心参数为500～600rpm离心1～2min。

优选的，所述细胞培养基为RPMI-1640培养基。

优选的，所述复苏液包括以下成分：L-脯氨酸25μg/L、亚硒酸钠50mg/L、丙酮酸钠2.2mg/L、NaOH 0.5mg/L、氯化镁0.4mg/L、黄芪甲苷20mg/L、白术内酯Ⅱ25mg/L、泛影酸钠18mg/L，余量是细胞培养基。

另一方面，本发明提供一种CAR-T细胞复苏液，该复苏液包括以下成分：L-脯氨酸10～50μg/L、亚硒酸钠10～100mg/L、丙酮酸钠2.0～2.2mg/L、NaOH 0.2～0.5mg/L、氯化镁0.2～0.4mg/L、黄芪甲苷15～25mg/L、白术内酯Ⅱ10～50mg/L、泛影酸钠15～30mg/L，余量是细胞培养基。