[发明专利]一种神经干细胞免疫调节功能的检测方法

说明书

本发明公开了一种神经干细胞免疫调节功能的检测方法：(1)悬浮神经球贴壁培养；(2)神经干细胞灭活；(3)CFSE标记hPBMC；(4)共培养；(5)淋巴细胞亚群及增殖检测；(6)细胞因子检测；(7)数据处理；(8)结果分析。本发明利用hPBMC，体外模拟人体免疫反应，研究不同来源、不同代次、不同培养方式等神经干细胞的免疫调节作用，从而对神经干细胞的工艺开发提供依据。本发明将悬浮培养的神经球消化成单细胞，然后贴壁，有利于对其进行数量控制和灭活，利用CFSE随细胞分裂在子代中平均分配的特性，结合不同淋巴细胞亚群抗体，可用流式细胞仪直观地检测特定细胞亚群地增殖情况。将各检测指标进行组合，减少操作步骤，节约实验材料，降低成本。

技术领域

本发明涉及一种神经干细胞免疫调节功能的检测方法，属于干细胞技术研究和免疫学领域。

背景技术

神经干细胞(neural stem cell，NSC)是指存在于神经系统中，具有分化为神经神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的潜能，从而能够产生大量脑细胞组织，并能进行自我更新，并足以提供大量脑组织细胞的细胞群。神经干细胞技术近年来发展迅速，其在中枢神经损伤疾病等方面有着巨大的临床应用潜力。不仅如此，神经干细胞治疗的优势明显，比如安全、治疗材料来源充足、治疗疾病范围广阔等，许多国家都将其作为重要的研究发展方向之一。

神经干细胞疗法治疗疾病主要有以下作用机制：1、患病部位组织损伤后释放各种趋化因子，可以吸引神经干细胞聚集到损伤部位，并在局部微环境的作用下分化为不同种类的细胞，修复及补充损伤的神经细胞。2、缺血、缺氧导致的血管内皮细胞、胶质细胞的损伤，使局部通透性增加，在多种黏附分子的作用下，神经干细胞可以透过血脑屏障，高浓度的聚集在损伤部位。3、神经干细胞可以分泌多种神经营养因子，促进损伤细胞的修复。4、神经干细胞可以增强神经突触之间的联系，建立新的神经环路。

尽管人们对干细胞的生物学调控机制越来越了解，但神经干细胞治疗的应用仍然具有挑战性。随着越来越多的关于其治疗可塑性证据的出现，证明神经干细胞不仅通过细胞替代，而且通过免疫调节作用来发挥其有益作用，免疫细胞与移植神经干细胞及其子代之间的相互作用似乎决定了内源性再生反应的有效性、作用机制以及移植后神经干细胞的命运和功能整合。因此更好地了解不同来源、不同代次、不同培养方式等不同工艺路线的神经干细胞的免疫调节作用，对于进一步开发有效的神经干细胞治疗药物至关重要，但是目前还没有具体的可应用于神经干细胞免疫调节的检测方法。

动物模型已在干细胞技术领域被广泛应用，但动物模型与人体之间存在种属差异，对神经干细胞在人体内的免疫调节功能检测存在一定局限性，需要开发一种更接近于人体的体外模型或方法。由于人外周血单核细胞(human peripheral blood mononuclearcells，hPBMC)直接来自于人体，研究者们认为其免疫系统几乎与人体的免疫相同，因此我们可以利用人外周血单核细胞在体外进行神经干细胞免疫调节功能检测，为神经干细胞药物的工艺开发提供依据。

发明内容

针对上述神经干细胞研究现状的需求及现有技术的不足，本发明提供了一种神经干细胞免疫调节功能的检测方法，该方法对悬浮培养的神经球适用，采用CFSE标记细胞可以直观地判断神经干细胞对不同免疫细胞亚群增殖的影响，实现细胞增殖、细胞亚群同时检测，节省时间，避免分别检测所造成的材料浪费。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种神经干细胞免疫调节功能的检测方法，包括以下步骤：

(1)悬浮神经球贴壁培养：用人层粘连蛋白包被孔板，备用；收集悬浮培养的神经干细胞球，离心，弃上清，加入accutase消化酶消化，加入适量生理盐水稀释消化液，离心，弃上清，取神经干细胞用NSC培养基重悬接种至包被好的孔板，培养；

(2)神经干细胞灭活：向上述贴壁培养的神经干细胞中加入丝裂霉素C，孵育；弃去培养基，加入PBS缓冲液清洗2次，备用；