[发明专利]一种高效敲除NK细胞中CD96基因的方法

说明书

本发明公开了一种高效敲除NK细胞中CD96基因的方法，所述方法是利用CRISPR/Cas9基因编辑系统，以电穿孔转染方式将sgRNA与Cas9蛋白的复合物导入经扩增的NK细胞中，其中：sgRNA的序列选自SEQ ID NO.1～10所示序列中的任意一种。采用本发明所述方法可实现对NK细胞中CD96基因的敲除，不仅敲除效率较高，而且所获得的不表达CD96的NK细胞可解除CD155+肿瘤细胞对NK细胞的免疫抑制作用，相对于野生型NK细胞，在体内、体外实验中均展现出更强的抗肿瘤活性，明显提高了NK细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤活性，可望开发成安全有效的抗肿瘤生物制剂。

技术领域

本发明涉及一种高效敲除NK细胞中CD96基因的方法，属于基因编辑技术领域。

背景技术

自然杀伤细胞(natural killer cell，NK细胞)是机体重要的免疫细胞，来源于骨髓淋巴样干细胞，其分化、发育依赖于骨髓及胸腺微环境，主要分布于骨髓、外周血、肝、脾、肺和淋巴结。NK细胞不同于T、B细胞，是一类无需预先致敏就能非特异性杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的淋巴细胞，它不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生，能够识别靶细胞、杀伤介质。

研究表明：虽然NK细胞具有强大的天然抗肿瘤功能，且无需肿瘤细胞抗原(靶点)预先致敏即可识别并攻击肿瘤细胞，但瘤体组织内活化NK细胞数量少、活性低是针对实体肿瘤的NK细胞免疫治疗疗效的主要障碍，尽管采用体外扩增方法可获得高数量、高纯度NK细胞，但过继输注的NK细胞只有很少部分透过毛细血管进入实体肿瘤微环境，接触并杀伤肿瘤细胞，并不能解决瘤体组织内活化NK细胞数量少这个问题；另外，研究者陆续发现TIGIT(T cell immunoglobulin and ITIM domain)是新的免疫检查点之一，它与配体PVR/CD155(脊髓灰质炎病毒受体)结合可显著抑制T细胞或NK细胞的免疫应答；而CD96和TIGIT共同拥有一个受体，即PVR/CD155(脊髓灰质炎病毒受体)，在小鼠模型中敲除CD96基因可增强NK细胞的抗肿瘤活性。

尽管抗CD96抗体在动物水平的研究中展现出了理想的疗效，但目前还没有靶向CD96的药物被批准上市。

另外，基因编辑技术是研究功能基因组的重要技术手段，目前已经发展了四代基因编辑技术：大范围核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶、CRISPR等，其中，CRISPR系统因其高效、廉价而被广泛应用。CRISPR/Cas9是一种来源于原核生物的新型核酸酶系统，它由导向序列sgRNA和核酸酶Cas9两种元件组成，目前采用CRISPR/Cas9系统已经成功的在人、鼠、斑马鱼、拟南芥、水稻、果蝇、家蚕等物种中实现了基因敲除，但至今未见对NK细胞中CD96基因进行敲除的相关报道。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种高效敲除NK细胞中CD96基因的方法，从而获得不表达CD96的NK细胞，以提高NK细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤活性，使其能开发成安全有效的抗肿瘤生物制剂，为过继免疫治疗肿瘤及病毒感染性疾病(例如HIV/AIDS、新型冠状病毒肺炎/COVID-19)提供新的生物制剂。

为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种高效敲除NK细胞中CD96基因的方法，所述方法是利用CRISPR/Cas9基因编辑系统，以电穿孔转染方式将sgRNA与Cas9蛋白的复合物导入经扩增的NK细胞中，其中：sgRNA的序列选自SEQ ID NO.1～10所示序列中的任意一种。

一种优选方案，sgRNA的序列选自SEQ ID NO.5或9或10所示序列。

一种优选方案，所述复合物中，sgRNA与Cas9蛋白的质量比为1:(3～5)。

进一步优选方案，所述复合物中，sgRNA与Cas9蛋白的质量比为1:4。

一种优选方案，所述sgRNA经过磷酸化修饰。