[发明专利]一种定量检测鳗鲡疱疹病毒的引物对和试剂盒

说明书

本发明提供了一种定量检测鳗鲡疱疹病毒的引物对和试剂盒，属于分子生物学技术领域。本发明所提供的引物对基于鳗鲡疱疹病毒囊膜蛋白ORF49基因；使用本发明所提供的鳗鲡疱疹病毒定量检测试剂盒，可针对鳗鲡疱疹病毒可潜伏感染的特性，实现疑似鳗鲡疱疹病毒病病样的快速、准确定量检测，具有灵敏度高、特异性强、重复性好等特点，提高无症状鳗鲡中鳗鲡疱疹病毒的检出率，对生产中鳗鲡“脱黏败血综合征”的防控具有重要意义。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种定量检测鳗鲡疱疹病毒的引物对和试剂盒。

背景技术

鳗鲡疱疹病毒（Anguillid herpesvirus, AngHV）是养殖鳗鲡的一种重要病毒性病原，由Sano等首次从日本养殖的日本鳗鲡（Anguilla japonica）体内分离。此后，从世界多地的不同品种鳗鲡体内分离出鳗鲡疱疹病毒，血清学和基因序列分析表明，亚洲和欧洲分离的鳗鲡疱疹病毒为同一病毒株。前期研究中，课题组用PCR法从福建省养殖的鳗鲡体内检测出鳗鲡疱疹病毒，并利用鳗鲡卵巢细胞系（Eel ovary cell line, EO）从鳗鲡“脱黏败血综合征”病料中分离出鳗鲡疱疹病毒，这是我国大陆首次分离出该病毒。

鳗鲡“脱黏败血综合征”是幼鳗养殖阶段的主要疫病，病鳗常呈现“脱黏”、“红头”、“败血”等症状，具有发病率高、传染性强、死亡量大等特点；若成鳗发病，则发病急、病症严重，多呈现“败血”症状，引起大量死亡，给养殖业者造成严重的经济损失。攻毒实验和流行病学分析表明，鳗鲡疱疹病毒就是鳗鲡“脱黏败血综合征”的致病病原。流行病学调查表明，鳗鲡疱疹病毒可潜伏感染，其致病性与环境、水温等密切相关，水温低时一般不发病，而水温升高时，发病率也升高。

鳗鲡疱疹病毒属于疱疹病毒目(Herpesvirales)、鱼类疱疹病毒亚科（Alloherpesviridae）、鲤疱疹病毒属（Cyprinivirus），其基因组为线性双链DNA，基因组全长248 kb，含136个开放阅读框（ORF），由一段独特的长序列以及两侧11 kb末端重复序列组成。基因序列分析表明，鳗鲡疱疹病毒与鱼类疱疹病毒亚科的其他病毒序列和基因序列的同源性均较低，仅有19％~58％。

目前，已建立的鳗鲡疱疹病毒检测方法中原位杂交法操作复杂，且需要使用同位素标记，对操作人员的健康可能存在安全隐患；免疫过氧化物酶单层试验和免疫间接荧光抗体试验均需要鳗鲡疱疹病毒的抗体，不易获得；常用的PCR法无法对病毒进行准确定量，且扩增后必须进行琼脂糖电泳才可以观察扩增结果，操作步骤多，需时久。随着分子生物学技术的发展，qPCR法因其快速、灵敏、准确等特点被广泛用于病原检测。本发明拟针对鳗鲡疱疹病毒可潜伏感染的特性，提供一种利用SYBR Green qPCR法定量检测鳗鲡疱疹病毒的引物和试剂盒，区别于TaqMan探针法，具有特异性强、灵敏度高、成本低、操作简单等优点，为快速、准确的定量检测鳗鲡疱疹病毒提供了新的检测手段，提高无症状鳗鲡中鳗鲡疱疹病毒的阳性检出率，有利于鳗鲡“脱黏败血综合征”的提前预防。

发明内容

本发明的目的是提供一种定量检测鳗鲡疱疹病毒的引物对和试剂盒，试剂盒可用于鳗鲡组织和细胞样品中鳗鲡疱疹病毒的快速、定量检测，具有特异性强、灵敏度高、重复性好等特点。

本发明解决其技术问题所采用的方案是：提供一种用于定量检测鳗鲡疱疹病毒的特异性引物对，所述引物对是通过从设计的10对引物中优选获得，针对的靶标基因为鳗鲡疱疹病毒ORF49，所述引物序列为：

AngHV_qF: 5´-CCGTGGTGGTGCCTCTTATCTACA-3´

AngHV_qR: 5´-TCCTCCGCGGCGTCCACAG-3´