[发明专利]一种检测蔬菜软腐果胶杆菌的特异性PCR引物和qPCR引物及方法和应用

说明书

本发明涉及一种检测蔬菜软腐果胶杆菌Pectobacterium polaris的特异性PCR引物和qPCR引物及方法和应用。本发明通过对蔬菜软腐果胶杆菌P.polaris及其近缘种和其他病原菌等138个细菌菌株进行了基因聚类分析，得到四个P.polaris特异基因。本发明基于得到的P.polaris特异基因设计了PCR和qPCR引物，并且经实验验证，PCR和qPCR引物均具备高度的灵敏度和特异性，最低可以检测1pg的样品。本发明提供的PCR和qPCR引物可以准确鉴别出早期蔬菜软腐病样是否携带P.polaris，在蔬菜软腐病的早期诊断中具有重要意义。

技术领域

本发明涉及分子检测技术领域，尤其涉及一种检测蔬菜软腐果胶杆菌的特异性PCR引物和qPCR引物及方法和应用。

背景技术

由软腐果胶杆菌Pectobacterium spp.引起的细菌性软腐病是蔬菜上普遍发生的一类毁灭性病害，主要危害叶柄、叶片，产生水渍状病斑，严重时导致整棵植株腐烂死亡并散发恶臭气味，严重影响了蔬菜产品的产量和质量，制约着我国蔬菜产业的发展。

Pectobacterium属目前包含19个种：P.atrosepticum,P.wasabiae,P.betavasculorum,P.carotovorum,P.cacticidum,P.parmentieri,P.aroidearum,P.peruviense,P.polaris,P.punjabense,P.fontis,P.zantedeschiae,P.aquaticum,P.odoriferum,P.versatile,P.brasiliense,P.actinidiae,P.polonicum and P.parvum(Portier et al.2019；Pasanen et al.2020).病原菌种类的准确鉴定对于蔬菜软腐病防治措施的制定非常重要。目前对于软腐果胶杆菌分类鉴定方法主要包括两类：一类是主要基于形态学、生理生化特征等的传统鉴定方法，这些鉴定方法耗时较长、程序繁琐、准确性低，而且还要求鉴定者具有良好的经验和专业背景知识，难以满足病原菌鉴定中快速、准确、稳定的检测要求；第二类是分子生物学鉴定手段，如保守基因如16S rDNA、pmrA等序列进化分析、ITS-RELP、多位点序列分析MLSA等，但操作过程复杂、耗时较长，成本较高，且对操作人员存在一定技术要求。除此之外，第二类方法还包括兼具特异、灵敏、快速、简便、准确、易自动化等突出优点的特异PCR/qPCR鉴定方法，其只要求工作者有简单的分子操作技能，现已越来越多地用于鉴定植物病原菌的工作中。

目前已有一些Pectobacterium spp.特异引物的报道，如Pectobacterium属特异引物Y1/Y2，P.atrosepticum特异引物Eca1f/Eca2，P.wasabiae特异引物PhF/PhR，P.brasiliense特异引物BR1f/L1r以及P.odoriferum特异引物srlE-F1/srlE-R1(Li etal.2020)。但是目前尚未有针对P.polaris的特异性引物。

发明内容

为了至少解决现有技术中的一个技术问题，本发明提供一种检测蔬菜软腐果胶杆菌的特异性PCR引物和qPCR引物及方法和应用。

第一方面，本发明提供一种检测蔬菜软腐果胶杆菌Pectobacterium polaris(缩写为P.polaris)的特异性PCR引物，包括如下引物：

30452-S:5’-TTCATTTTACCTGCGGCCCT-3’，

30452-AS:5’-GCCCCTTCCGTAGACATCAG-3’。

本发明同时提供一种检测蔬菜软腐果胶杆菌Pectobacterium polaris的特异性qPCR引物，包括如下引物：

98123-qS:5’-ACCCTGAAATTGTGTCGAAATGG-3’，