[发明专利]一种猪血清样中病原抗体ELISA检测试剂盒

说明书

本发明涉及一种通过使用特异性抗体捕获猪源抗原加工提呈细胞APCs上负责加工提呈抗原的猪白细胞抗原II类DR分子（SLA‑DR），将SLA‑DR上提呈的抗原肽以三氟乙酸洗脱后，脱盐处理重悬后进行质谱分析以测定抗原肽氨基酸序列，鉴定出猪特定病原所有编码的蛋白中可被机体抗原提呈细胞所加工提呈的抗原肽序列，并通过基因工程的方法将以上方法获得的CD4⁺T表位抗原肽分别与NanoLuc荧光素酶融合后使用大肠杆菌进行体外重组表达并纯化，作为一种人工抗原与相应病原感染的猪血清样本进行ELISA检测，以寻找可被病原感染的猪血清样本识别的CD4⁺T表位抗原肽序列，进一步将所有抗体ELISA检测为阳性的抗原肽序列串联后在大肠杆菌中进行重组表达，作为人工抗原用于给定病原的特异性抗体检测。

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种猪血清样中病原抗体ELISA检测试剂盒，特别涉及分离和鉴定PRRSV抗原肽及其应用，特别是用于猪血清样中病原抗体ELISA检测的方法。

背景技术：

宿主机体的免疫系统在对外源性的病原感染，抗原刺激或疫苗（以下统称为外源性免疫原）免疫的过程做出反应的过程中，主要通过宿主免疫系统中的抗原提呈细胞（APCs）对外源性的抗原进行捕获，并进行加工提呈，将完整的外源性免疫原蛋白降解切割为长度为12-24的氨基酸长度的抗原肽片段，以上的抗原肽片段可以装配与主要组织相容性复合物（MHC）II类分子的抗原肽结合槽中，形成“MHC-II-抗原肽”复合物。在猪体内，负责完成此过程的MHC-II类分子为猪白细胞抗原-II DR（Swine leukocyte antigen DR，SLA-DR）并表达于多种APCs表面，如猪肺泡巨噬细胞，或淋巴组织内的巨噬细胞和树突状细胞。猪APCs表面的SLA-DR分子所加工提呈的抗原肽，能够作为猪特异性CD4⁺T细胞表位，被猪体内相应的CD4⁺T细胞所识别，最终激活猪机体的适应性免疫应答，产生免疫记忆，保护机体免受病原的感染。

因此在猪免疫系统活化的过程中，最终引发免疫应答的有效抗原成分仅仅是外源性免疫原被APCs加工提呈后长度为12-24个氨基酸的抗原肽片段（即猪特异性CD4+ T表位），而并非完整的免疫原。因此，直接使用来源于免疫原的CD4⁺T表位片段刺激机体即可激活机体的免疫系统，产生与使用完整外源性蛋白抗原刺激机体免疫系统类似的免疫应答。此外，使用来源于完整外源性免疫原的一个或多个CD4⁺T表位片段通过全人工合成或是基因工程重组表达的方法可以表达为一种仅含有CD4⁺T表位的重组蛋白，所获得的重组蛋白可以作为一种基因工程疫苗用于猪传染病的预防。

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV）引起的以母猪流产和仔猪呼吸障碍为主要特征的病毒性传染病，并能引起严重的免疫抑制。该病毒已在全球猪群中广泛传播，给世界养猪业造成了巨大的经济损失，已成为全球规模化猪场的主要疫病之一，也是全球猪病控制上的一大难题。市场上现有的PRRSV抗体ELISA检测试剂盒，主要以PRRSV病毒的主要核衣壳蛋白N为包板抗原进行检测，存在因为病毒抗原变异所导致的漏检现象。