[发明专利]一种利用酵母表达系统有效表达NaD1蛋白的方法

说明书

本发明公开了一种利用酵母表达系统有效表达NaD1蛋白的方法。本发明将花烟草NaD1基因双酶切连接至pPIC9K载体的EcoR I和Not I间构建重组质粒pPIC9K‑NaD1并得到转入GS115中得到重组NaD1蛋白表达菌株，该菌株能够有效稳定和大量地表达重组NaD1蛋白，纯化后的重组蛋白总量为1mg，蛋白纯度达到85％。产物经Western Blot，SDS‑PAGE检测，实际重组蛋白分子量在20kDa左右，理论大小11kDa左右，且推测蛋白在毕赤酵母中可能发生了糖基化修饰以及存在多聚体形式。本发明通过酵母表达系统成功表达了NaD1蛋白，为进一步研究NaD1蛋白的作用机制提供实验依据。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种利用酵母表达系统有效表达NaD1蛋白的方法。

背景技术

目前，以细胞工程生产药用蛋白已成为世界上生物技术制药的三大潮流之一。外源蛋白表达系统中有一项重要的科研技术为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，在异源蛋白表达中使用该技术的时间可从1987年追溯至今，研究表明500多种来自各个方面的蛋白实现了毕赤酵母分泌表达，其中投入产业化的药用蛋白占据相当重要的一部分。毕赤酵母既有原核生物大量繁殖培养较为容易等特性，又有真核生物可对基因产物进行正确折叠以及在翻译后修饰加工的能力。

Nicotiala alata defensin 1(NaD1)蛋白是一种来自观赏性花烟草(Nicotianaalata)的植物防御素。根据前期的研究发现，NaD1蛋白在花烟草Nicotiana alata中杀死真菌细胞的机制，是真菌细胞壁在穿过质膜和进入真菌细胞质之前发生特异性相互作用。进入细胞后，NaD1会迅速引发活性氧(ROS)的产生，真菌质膜的透化作用以及细胞死亡。因此它对尖孢镰刀杆菌(Fusarium oxysporum)，灰霉菌(Botrytis cinerea)，念珠菌(Candidaalbicans)等多种致病性真菌皆具有良好的抗菌活性。也有研究表明NaD1蛋白可通过与磷酸酰肌醇4,5-二磷酸的特异性和高亲和力相互作用介导了针对肿瘤细胞系的活性，但是其详细的机理目前还有待进一步的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分泌表达花烟草NaD1基因的毕赤酵母工程菌及其构建方法，能高效、安全地进行花烟草NaD1基因的胞外分泌表达。

实现本发明目的的技术方案如下：

花烟草NaD1基因载体pPIC9K-NaD1，其碱基序列如SEQ ID No.1。

花烟草NaD1基因的工程菌，其受体菌为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，转入有上述载体pPIC9K-NaD1。

一种利用酵母表达系统有效表达NaD1蛋白的方法，包括如下步骤：

(1)将花烟草NaD1基因双酶切连接至pPIC9K载体的EcoR I和Not I间构建重组质粒pPIC9K-NaD1，重组质粒的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

(2)质粒经Sac I内切酶线性化后进行琼脂糖凝胶电泳，回收酶切产物；电转化回收产物于GS115感受态细胞中，获得重组阳性克隆；

(3)将重组阳性克隆接种于BMGY液体培养基中，30℃200rpm条件下培养，然后，离心去液体培养基上清液，再接种于BMMY培养基中，加入消泡剂，30℃200rpm条件下培养，培养完成后；再加入10mL甲醇诱导，30℃200rpm培养，8000rpm离心，取上清液，所述上清液中含有可溶性NaD1蛋白。

所述BMGY液体培养基中培养24小时，在BMMY培养基中，加入消泡剂培养24小时再加入甲醇诱导，继续培养24小时。