[发明专利]一种产丁酸的枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用

说明书

本发明提供一种产丁酸的枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用。所述枯草芽孢杆菌的基因组上缺失自溶相关基因和乙酸代谢相关基因；同时，所述基因组上还包含丁酸合成相关基因BCoAT。本发明中，将底盘细胞枯草芽孢杆菌中的自溶相关基因和乙酸代谢相关基因敲除，同时将丁酸合成相关基因BCoAT插入枯草芽孢杆菌的基因组上，优化枯草芽孢杆菌的丁酸代谢途径，敲除旁路基因并引入异源代谢途径，最终优化得到的枯草芽孢杆菌的丁酸产量相对原始菌的产量提高了6.95倍。

技术领域

本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种产丁酸的枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用。

背景技术

丁酸(butyric acid，BA)是肠道菌群代谢产生的短链脂肪酸(SCFA)之一，主要以游离的形式存在。人和动物胃肠道中都栖息了大量的产丁酸微生物。已有研究证实，丁酸具有许多重要的生理功能，参与物质代谢、促进肠道组织发育、增强机体免疫等生理活动。

目前，丁酸作为一种广泛应用于食品、化学和医药等行业的有机酸，其生产工艺以化学合成为主，但是随着人们环保意识的增强和石油能源价值的提高，生物合成法越来越受到社会的关注。由于丁酸发酵是一种终产物抑制发酵，因此微生物发酵法生产丁酸收率较低且经济效益差，难以替代化学合成法。因此，为了进一步提高丁酸发酵的产量，研究人员对发酵方法、发酵培养基及发酵菌株等进行了改进。

CN109355318A公开了一种发酵生产丁酸的方法，包括如下步骤：将酪丁酸梭菌(Clostrdium tyrobutyricum)活化，制备成种子液；以甘露醇和葡萄糖的混合物为碳源，配制液体培养基，并经过灭菌；将种子液接种于液体培养基中，在温度为35～39℃，pH为5～7，转速为100～300rpm的条件下，进行细胞发酵，得到丁酸。此发明可以提高目标产物丁酸的转化率和选择性，从而降低后续的分离纯化成本。然而，该方法需要以大量的葡萄糖、甘露醇作为发酵碳源，若以废弃物作为碳源，则存在大量毒性抑制物，因此该发酵方法成本较高。

CN108441462A公开了一株枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)ΔWB800及其制备方法，通过对枯草芽抱杆菌ΔWB800菌株的自溶相关基因skfA、sdpC、lytC和xpf的敲除，获得了自溶抑制菌株ΔWB800，该菌株具有耐热、耐酸、耐胆盐的优良性能，显现出了较好的工业应用前景。虽然，原始枯草芽孢杆菌具有一定的产丁酸能力，但丁酸产量较低，该发明仅提高了菌株耐热和耐酸等性能，并未明显提升枯草芽胞杆菌的丁酸产量。

因此，提供一种丁酸产量较高的枯草芽孢杆菌对于本领域而言具有重要的意义。

发明内容

鉴于现有技术中存在的问题，本发明提供一种产丁酸的枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用。所述枯草芽孢杆菌的丁酸产量较高，且构建方法成熟，成功率较高，适用于丁酸的发酵和生产。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种产丁酸的枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌的基因组上缺失自溶相关基因和乙酸代谢相关基因；同时，所述基因组上还包含丁酸合成相关基因BCoAT。

其中，丁酸合成相关基因BCoAT，即(丁酰CoA:乙酸)CoA转移酶(butyryl-CoA:acetate CoA-transferase，BCoAT)基因，是一种丁酸合成非经典途径上所涉及的基因。本发明中，通过敲除丁酸自溶相关基因和旁路代谢相关基因，同时插入丁酸合成相关基因BCoAT，能够明显提高枯草芽孢杆菌的丁酸产量。

作为本发明优选的技术方案，所述基因组上还包括硫解酶基因(thiolase，THL)、β-羟基丁酰CoA脱氢酶基因(β-hydroxybutyl-CoA dehydrongenase，BHBD)、丁酰CoA脱氢酶基因(butyryl-CoA dehydrogenase，BCD)和巴豆酸酶基因(crotonase，CRO)。