[发明专利]基于破伤风人免疫球蛋白-金簇为荧光探针的破伤风抗原测定方法

说明书

本发明公开一种基于破伤风人免疫球蛋白‑金簇为荧光探针的破伤风抗原测定方法，其特征是基于破伤风人免疫球蛋白‑金簇的荧光和免疫原性的双功能特性，一方面，金簇具有荧光特性，另一方面它能够与破伤风抗原结合，利用金簇在检测线与控制线荧光强度比值的变化，直接用于破伤风抗原的测定。测定体系的荧光强度比值变化值∆（T/C）与破伤风抗原浓度在0.4~6.0μg/mL的对数呈线性关系，检测限为0.03μg/mL。本发明所构建的方法操作简便、检测时间短、特异性高、灵敏度好等优点，可用于破伤风抗原的含量测定。

技术领域

本发明涉及以破伤风人免疫球蛋白-金簇为荧光探针的破伤风抗原测定方法，属于生物化学及纳米技术领域。

背景技术

破伤风是由破伤风梭状芽孢杆菌分泌的神经毒素而引起的具有急性感染性、中毒性的疾病，它具有潜伏期短、起病急、病情严重、病死率高等特点。破伤风神经毒素由两个二硫化物连接亚基组成，重链(100000 道尔顿)含有结合和易位结构域，轻链(50000 道尔顿)含有锌依赖的蛋白酶结构域。破伤风抗原的检测方法与破伤风疫苗生产的安全性关系密切，目前为止，破伤风抗原均使用豚鼠或小鼠进行生物制剂的风险评估，其在伦理和经济方面的可接受性较低。因此，寻找一种新的破伤风抗原的检测技术在医学诊断及疫苗研发等方面具有重要的意义。

金纳米团簇(AuNCs)具有良好的光稳定性、较大的斯托克位移和毒性低等特点，优于其他金属纳米团簇和量子点，正因为如此，它已经成为一种新型的荧光探针，并广泛应用于光学传感、生物成像和体外生物测定。在过去的几年里，各种生物分子(如蛋白质、多肽和氨基酸)已经被广泛用作稳定金核的生物模板。生物分子介导的金纳米团簇对生物体具有较低的毒性和良好的生物相容性，有望成为生命科学和环境研究的新型分析工具。研究人员已经发现许多不同的蛋白质，包括人免疫球蛋白、胃蛋白酶、辣根过氧化物酶、胰岛素、溶菌酶和胰蛋白酶等，均可以作为制备金纳米团簇的生物配体，此外，这些金纳米团簇可以保留生物分子的固有功能(如催化活性、识别能力，免疫原性等)。以破伤风人免疫球蛋白为生物模板，能构建具有红色荧光的破伤风人免疫球蛋白-金簇，该金簇同时保持荧光和免疫原性的双功能特性，并能够很好的应用于破伤风抗原的检测。因此在生物传感器和疫苗研发等领域研究中具有巨大的应用前景。

本发明以破伤风人免疫球蛋白为生物模板，构建了破伤风人免疫球蛋白-金簇荧光探针，并利用此探针建立了一种测定破伤风抗原的新方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用破伤风人免疫球蛋白-金簇为荧光探针，建立一种测定破伤风抗原的新方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种基于破伤风人免疫球蛋白-金簇为荧光探针的破伤风抗原测定方法，其特征是基于破伤风人免疫球蛋白-金簇的荧光和免疫原性的双功能特性，一方面，金簇具有荧光特性，另一方面它能够与破伤风抗原结合，利用金簇在检测线与控制线荧光强度比值的变化，直接用于破伤风抗原的测定。

2、所使用的破伤风人免疫球蛋白-金簇采用破伤风人免疫球蛋白直接还原氯金酸的方法制备：将浓度为17.8~142 mg/mL 的破伤风人免疫球蛋白溶液和浓度为1.5~3.5mol/L的氢氧化钠溶液加入到浓度为0.5~7.5 mmol/L的氯金酸溶液中，混匀，置于25~60°C水浴恒温反应15~150分钟，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行透析纯化处理，得到破伤风人免疫球蛋白-金簇荧光材料水溶液。

3、所使用的破伤风人免疫球蛋白-金簇采用破伤风人免疫球蛋白直接还原氯金酸的方法制备：将浓度为2.5 moL/L的NaOH溶液与浓度为2.5 mmoL/L氯金酸依次加入到为59.3 mg/mL的人免疫球蛋白溶液中，混匀后置于37℃恒温水浴槽中孵育30分钟。待反应结束后用分子量为3500的透析袋对反应液透析纯化处理，得到人免疫球蛋白-金簇荧光材料水溶液。