[发明专利]一种用荧光光谱法测定硫酸化糖胺聚糖浓度的方法

说明书

本发明公开了一种用荧光光谱法测定硫酸化糖胺聚糖浓度的方法，荧光探针带有一定数量的精氨酸，利用精氨酸上的氨基与糖链上的硫酸根离子发生静电相互作用，一系列的荧光探针分子能够沿着糖链整齐排列形成稳定的荧光复合物，由于复合物中的荧光发色基团的空间距离小，因而导致原来的荧光发射带产生位移，通过计算两处荧光强度的比值，实现硫酸化糖胺聚糖浓度的测定。本发明检测结果准确，试验结果重现性较好，灵敏度高；试验材料简单，节省大量时间。

技术领域

本发明属于药物分析检测领域，具体涉及一种用荧光法测定硫酸化糖胺聚糖浓度的方法。

背景技术

LFG(Low Molecular Weight Fucosylated Glycosaminoglycan，低分子量岩藻糖化糖胺聚糖，以下简称“LFG”)是从海洋生物海参属动物中提取并经进一步精制、半合成而得。岩藻糖化糖胺聚糖(Fucosylated Glycosaminoglycan,FGAG)是一类从棘皮动物体壁中获得的带有硫酸化岩藻糖侧链取代的糖胺聚糖衍生物。不同来源的FGAG的共同点主要表现在组成单糖包括D-2-乙酰胺基-2-脱氧半乳糖(D-GalNAc)、D-葡萄糖醛酸(D-GlcUA) 和L-岩藻糖(L-Fuc)以及它们的硫酸酯。其中，D-GlcUA和D-GalNAc通过β-(1-3)及β -(1-4)糖苷键交替连接形成糖胺聚糖的主链，而L-Fuc则以侧链形式连接于主链 (Ricardo P.et al.,JBC,1988,263(34):18176；Kenichiro Y.et al.,Tetrahedron Lett,1992, 33(34):4959)。多种海参来源的FGAG具有强效抗凝血活性，具有重要的预防和临床治疗血栓性疾病的药用价值。

硫酸化类糖胺聚糖不含有发色团，无法用吸收光谱法检测，因此不能良好检测硫酸化类糖胺聚糖药物浓度，以保障其临床质量。

发明内容

为解决上述问题，本发明旨在提供一种用荧光光谱法测定硫酸化糖胺聚糖浓度的方法，采用的技术方案如下：

一种用荧光光谱法测定硫酸化糖胺聚糖浓度的方法，利用精氨酸上的氨基与糖链上的硫酸根离子发生静电相互作用，一系列的荧光探针分子能够沿着糖链整齐排列形成稳定的荧光复合物，由于复合物中的荧光发色基团的空间距离小，因而导致原来的荧光发射带产生位移，通过计算两处荧光强度的比值，测定硫酸化糖胺聚糖的浓度。

所述荧光探针分子结构为：

所述的一种用荧光光谱法测定硫酸化糖胺聚糖浓度的方法，包括以下步骤：

(1)HEPES溶液的配制：取HEPES配制成溶液，用氢氧化钠调节pH至7.4；

(2)荧光探针分子溶液的配制：将荧光探针分子溶于步骤(1)的HEPES溶液中；

(3)硫酸化糖胺聚糖标准溶液的配制：将硫酸化糖胺聚糖溶于步骤(1)的HEPES溶液中并通过稀释得到硫酸化糖胺聚糖标准溶液；

(4)荧光光谱标准曲线：将步骤(2)的荧光探针分子溶液和步骤(3)的硫酸化糖胺聚糖标准溶液分别等体积混合后，加入石英样品池中，采集荧光发射光谱；记录荧光发射光谱图上新增发射峰波长处及原最大荧光发射峰波长处的荧光强度，以(新增发射峰波长处荧光强度)/(原最大荧光发射峰波长处荧光强度)的比值I为纵坐标，以硫酸化糖胺聚糖溶液的浓度为横坐标，制作标准曲线，获得线性方程；

(5)测定并计算待测硫酸化糖胺聚糖浓度；将待测样品溶液与步骤(2)的荧光探针分子溶液等体积混合后，加入石英样品池中，采集荧光发射光谱，记录(新增发射峰波长处荧光强度)/(原最大荧光发射峰波长处荧光强度)的比值I_样，代入步骤(4)所得线性方程，即可计算得待测样品中硫酸化糖胺聚糖浓度。