[发明专利]一种通过TMAO研究肠道代谢失衡诱导AD的细胞模型

说明书

本发明涉及一种通过TMAO研究肠道代谢失衡诱导建立AD细胞模型的新方法，步骤如下：使用氧化三甲胺(TMAO)诱导细胞48h后，即得AD细胞模型。本发明方法构建的模型的优势在于TMAO作为一种与肠道微生物相关的磷脂类代谢产物，与人们日常息息相关，能同时造成神经毒性损伤、氧化应激及Tau蛋白过度磷酸化，更契合AD病因及病机的复杂性，实验条件易控制且评价机制灵活。该模型体外将TMAO用灭菌的蒸馏水溶解，使母液浓度为5mol·Lsupgt;－1/supgt;，不需要经过老化处理可直接加入PC12和SH‑SY5Y细胞，通过检测细胞毒性和凋亡、细胞骨架和微管微丝蛋白变化及细胞氧化应激变化来评价模型。

技术领域

本发明属于细胞工程技术领域，尤其是一种通过TMAO研究肠道代谢失衡诱导AD的细胞模型，该模型是一种研究肠道代谢物对老年痴呆潜在影响的细胞模型。

背景技术

阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease,AD)，是一种不可逆的慢性神经退行性疾病，主要表现为记忆力渐进性丧失、认知功能下降、并有位于大脑的神经元及神经突触的大量缺失。AD是由多种病因引起的涉及多种病理机理机制并可出现多种病理表现的“多因异质性疾病”。它的一个重要病理特征为：β-淀粉样蛋白(amyloid-βprotein)聚集形成老年斑(SP)、Tau蛋白异常聚集形成神经纤维缠结(NFT)以及脑皮层和海马区神经细胞减少。随着研究的逐步深入，发生在AD病理早期的线粒体损伤与氧化应激在AD的发生、发展中起着主导的作用。其可能的分子机制是氧自由基等的活性代谢中间物的形成破坏细胞内的Ca²⁺平衡和突触功能、引起炎症反应、以及诱导细胞凋亡等。另一方面，肠道菌群平衡和代谢的功能退化与AD的发生可能存在这重要联系，近年来引起很大关注。

细胞模型是微观层面研究阿尔兹海默症的有效方法之一，建立体外AD细胞模型来模拟AD的发病机制是广泛使用的研究手段。可供选择的造模试剂依据诱导机制不同分为神经毒性损伤、氧化应激损伤以及Tau蛋白过度磷酸化，包括Aβ、Glu、FA、H₂O₂、OA等；细胞主要包括SH-SY5Y细胞、NG108-15细胞、PC12细胞等。其中Aβ的使用最为广泛，用20μmol·L^－1浓度的Aβ_1-42、Aβ_25-35进行诱导建立AD细胞模型。Aβ来自于其前体淀粉样蛋白前体蛋白(amy-loidprecursor protein，APP)第672～711残基裂解片段，APP经β-和γ-分泌酶连续剪切后形成长度在39～42个氨基酸的短肽。APP表达量增多时，可导致Aβ积聚形成SPs。据报道，Aβ可直接或间接对线粒体结构及功能造成损伤，诱发氧化应激和凋亡信号通路等级联反应，导致神经元细胞损伤。此外，Aβ积聚也会导致Tau蛋白过度磷酸化、突触连接障碍、炎症反应等。

然而，直接采用Aβ诱导AD的细胞模型忽略了Aβ的产生和沉积可能是导致AD发病的一系列变化中的一种后期结果而非最初诱因这一问题。为进一步深化了解诱发AD的上游分子机制，特别是肠道代谢失衡和氧化应激两方面的协同作用，本发明建立了使用氧化三甲胺(TMAO)来诱导AD的细胞模型。

TMAO是近年来备受关注的肠道菌群代谢物之一，TMAO进入循环后会影响胆固醇和甾醇代谢，增强巨噬细胞胆固醇积聚，是动脉粥样硬化的标志物。TMAO可潜在诱发氧化应激，与菌群代谢失衡有密切联系，已被证实与动脉粥样硬化之外的其他衰老相关疾病如心力衰竭、糖尿病等亦有关联。但其对阿尔茨海默病的影响目前尚知之甚少。用TMAO来构建AD体外细胞模型，将肠道菌群代谢和氧化应激联系起来，探索其对老年痴呆发生的潜在病理学作用，目前国内外尚未见相关文献报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种通过TMAO研究肠道代谢失衡诱导建立AD细胞模型的新方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种通过TMAO研究肠道代谢失衡诱导建立AD细胞模型的新方法，步骤如下：