[发明专利]一种重组海因消旋酶工程菌及其构建方法和用途

说明书

一种重组海因消旋酶工程菌及其构建方法和用途，以红球菌R04基因组DNA为模板，用PCR法扩增了编码海因消旋酶的基因；对其基因进行克隆、重组表达，获得一株高活性海因消旋酶基因工程菌；工程菌经发酵后可大量表达高活性重组海因消旋酶；当以D,L‑5′‑异丙基海因为底物利用生物酶法制备D‑缬氨酸时，该工程菌与HC01工程菌共同作用可以将转化速度提高12.12％，转化率可达99.0％以上。该工程菌可用于非天然D‑氨基酸及其衍生物的生物转化，加速D‑氨基酸的转化过程，提高D‑氨基酸转化效率。

技术领域

本发明属于酶蛋白分子工程领域，主要涉及一种含重组海因消旋酶工程菌的构建、表达及其用途。

技术背景

D-氨基酸及其衍生物广泛应用于医药、食品、农药、化妆品等领域，是合成抗菌和抗病毒药物、杀虫剂以及多肽合成的重要中间物。例如：D-缬氨酸可应用于生产新型广谱抗生素、多肽合成过程的缬氨酸保护剂等。D-缬氨酸杀虫菊酯能抑制昆虫酶系统活性，有效地防治棉花、蔬菜等作物的主要害虫，是一类广谱的很有发展前景的杀虫杀螨剂。在医学科研中，D-缬氨酸是重要的手性药物原料，如由其参与组入的放线菌D是一种抗肿瘤药物，还可以用其合成抗糖尿病及其并发症药物，还可以用来抑制纤维细胞的生长等。虽然D-缬氨酸应用领域的拓展和市场需求仍在扩大，但D-缬氨酸制备研究仍存在天然菌生物转化率低，生产工艺限制等问题，利用人为构建工程菌进行高效率转化，将成为氨基酸研究热点之一。

目前，D-缬氨酸制备方法有生物酶法、外消旋体优先结晶法及外消旋体化学拆分法等。生物酶催化转化的关键是生物催化剂的制备，它可以是微生物细胞，也可以是从微生物细胞中提取的酶。其优点在于立体选择性强，反应条件温和、公害少等，缺点是菌种筛选困难、产物后处理工作量大、酶制剂不易保存等。综合考虑，生物酶法仍不失为一种极有发展前途的方法。目前D-氨基酸类衍生物如D-缬氨酸的生产方式通常选用微生物海因法，D,L-5′-异丙基海因在富含海因消旋酶、D-海因酶和N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶的微生物的作用下，得到D-缬氨酸(图1)。底物5′-异丙基海因，其自发消旋速率远低于D-海因酶的水解速率，所以海因消旋酶成为整个多酶催化反应的限速酶。因此，对5′-单替代海因消旋的研究已成为由外消旋5′-单替代海因制备D-氨基酸反应动力学中的一个非常重要的组成部分。姚忠等研究了L-海因的消旋过程，对其动力学过程进行了分析表明，L-海因的消旋遵循碳负离子理论，消旋过程符合一级反应动力学过程。目前，关于5′-单替代海因的消旋对制备光学活性氨基酸的影响的文献报道非常少，海因消旋的部分问题也没有被完全揭示。因此，对于自发消旋速率较慢的底物，构建表达高活性重组海因消旋酶的工程菌显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是通过基因工程方法，构建工程菌高效表达海因消旋酶，用于弥补酶法制备D-氨基酸时底物5′-单替代海因消旋速率低于D-海因酶水解速率的缺陷，降低生产成本。

本发明以红球菌R04(Rhodococcus sp.R04)基因组DNA为模板，用PCR法分离克隆了一种海因消旋酶基因，DNA序列分析表明全长735bp，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA，不含内含子，共编码244个氨基酸残基。将此基因在大肠杆菌表达系统中表达，获得了可以高效表达目的基因的工程菌细胞。

本发明的一种海因消旋酶，它的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示的序列。

本发明的一种编码海因消旋酶的多核苷酸，其核苷酸序列为SEQ ID No.2所示的序列。

本发明利用分子克隆技术，将编码海因消旋酶多核苷酸直接克隆到表达载体—质粒pMAL-s，该质粒含有tac启动子，具有氨苄抗性，所构建pMAL-s-hyu2重组质粒，利用氯化钙法转化原核细胞—E.coli BL21(DE3)，得到工程菌pMAL-s-hyu2/E.coli BL21(DE3)。该工程菌在乳糖的诱导下获得可溶性表达，本发明所述海因消旋酶工程菌可用于制备D-氨基酸。