[发明专利]一种基于微卫星标记的中华倒刺鲃亲子鉴定试剂盒及其方法

说明书

本发明公开了一种基于微卫星标记的中华倒刺鲃亲子鉴定试剂盒及其方法。提取中华倒刺鲃个体样本的基因组DNA；PCR扩增：中华倒刺鲃亲子鉴定用引物组中的15对微卫星引物的每对引物的正向引物的5’端标记上荧光物质，利用上述引物组中的各标记荧光引物对获得的DNA基因组进行梯度PCR扩增，扩增产物在测序仪上进行毛细管电泳，读取每个个体的等位基因大小，获取基因分型数据；中华倒刺鲃家系的亲子鉴定分析：基于基因型数据进行亲本和子代数据分析，根据子代基因型和亲本基因型之间的相关性，确定子代与亲本间的亲子关系。本发明方法简单、快捷，可在中华倒刺鲃的种质鉴定、家系遗传管理方面推广应用，并为增殖放流效果评估提供了一种新的技术手段。

技术领域

本发明涉及鱼类育种和分子标记技术领域，涉及一种基于微卫星标记对中华倒刺鲃进行亲子鉴定的技术，具体为中华倒刺鲃亲子鉴定试剂盒及其微卫星PCR鉴定方法。

背景技术

中华倒刺鲃(Spinibarbus sinensis)隶属于鲤形目(Cypriniformes)、鲤科(Cyprinidae)、倒刺鲃属(Spinibarbus)，俗称“青波”，为长江上游干支流水系重要的经济鱼类之一，在乌江流域和赤水河中下游流域中的渔获物比例较高。中华倒刺鲃个体大、生性活泼，喜水质清澈的急流河滩，生长较快、杂食性，深受人民群众的喜爱。然而，近年来由于捕捞过度、水污染严重，以及水利工程建设及运行造成的栖息地破坏等因素影响，中华倒刺鲃野生资源日益枯竭，开展种资资源保护、恢复与资源增殖研究非常重要。

中华倒刺鲃资源的保护主要采用人工增殖的方式，即通过养殖中华倒刺鲃亲本，大规模繁殖出苗后，再人工放流至河流，补充其野生种群，迅速壮大野生资源量。由于中华倒刺鲃个体大、生长较快、饲养饵料来源广，适合于池塘、湖泊、水库、鱼类增殖站等开展集约化养殖。多年来，有关中华倒刺鲃营养特性、人工养殖和繁殖技术等的研究已非常成熟，基本可以实现规模化的成鱼生产，为苗种的大规模增殖放流奠定了基础。然而，一方面，中华倒刺鲃繁殖群体的持续圈养，容易造成亲本的近亲交配，从而造成种群的遗传多样性水平下降；另一方面，多省份多机构持续多年开展的增殖放流来源于不同的家系，如何快速有效辨别不同的中华倒刺鲃家系及来源，高效评估其增殖放流效果，已成为中华倒刺鲃种群资源恢复的主要障碍和重要课题之一。

微卫星(Microsatellite)是一类广泛存在于真核生物基因组中的具有高度变异性的简单重复DNA序列。它具有按照孟德尔方式分离、多态信息含量丰富、呈共显性遗传等特点，可简便快速的基因型检测，是一种广泛应用的遗传学分子标记。同时，由于微卫星标记的使用简单、结果稳定、费用低廉，已经在亲子鉴定中有较多的应用。目前，尚未发现将微卫星标记应用于中华倒刺鲃亲子鉴定的研究报道。本发明旨在基于微卫星标记建立中华倒刺鲃的亲子鉴定技术，为中华倒刺鲃的家系管理、种群遗传管理和增殖放流效果评估提供技术途径。

发明内容

本发明涉及一种基于微卫星标记的中华倒刺鲃亲子鉴定试剂盒及其微卫星PCR鉴定方法。

本发明采用的技术方案如下：

提供用于基于微卫星标记的中华倒刺鲃亲子鉴定用引物组，分别为：ZHDCB24、ZHDCB27、ZHDCB28、ZHDCB29、ZHDCB33、ZHDCB35、ZHDCB41、ZHDCB43、ZHDCB50、ZHDCB57、ZHDCB58、ZHDCB66、ZHDCB79、ZHDCB80、ZHDCB88，各引物的序列如下表：

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按上述方案，每对引物的正向引物的5’端标记有荧光物质。所述的荧光物质可选择为FAM荧光物质。