[发明专利]一种新型冠状病毒RBD核苷酸序列、优化方法与应用

说明书

本发明公开了一种新型冠状病毒RBD核苷酸序列、优化方法与应用。属于基因工程技术领域。优化步骤：（1）对野生型新型冠状病毒RBD核苷酸序列进行初步优化；（2）将宿主细胞特异性高表达分泌蛋白信号肽序列进行优化；（3）将人IgG1‑Fc核苷酸序列进行优化；（4）将步骤（2）优化后的宿主细胞特异性高表达分泌蛋白信号肽核苷酸序列、步骤（1）得到的初步优化新型冠状病毒RBD核苷酸序列、连接子核苷酸序列和步骤（3）优化后的人IgG1‑Fc核苷酸序列依次连接即可。与现有技术相比，本发明的有益效果：产生的克隆表达效率比野生新型冠状病毒RBD序列提高了约12倍，比中国仓鼠密码子偏性优化序列克隆表达效率提高了2倍。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及一种新型冠状病毒RBD核苷酸序列、优化方法与应用。

背景技术

冠状病毒是一类具有囊膜、基因组为线性单股正链的RNA病毒，是自然界广泛存在的一大类病毒。冠状病毒仅感染脊椎动物，与人和动物的多种疾病有关，可引起人和动物呼吸系统、消化系统和神经系统疾病。

新型冠状病毒SARS-CoV-2成为继HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV后感染人类的第7种冠状病毒。作为新突发传染病，针对新型冠状病毒肺炎，临床上尚无特异性治疗的药物，疫苗作为预防病毒性疾病最根本方法，是寄予希望的最有效途径。

新型冠状病毒的突刺蛋白(S)的受体结合域(RBD)，是病毒进入宿主细胞的关键部位，RBD蛋白可以和细胞的ACE2受体相互作用，打开细胞表面通道，使病毒颗粒得以进入细胞内，完成病毒入侵过程。据分析，大多数中和抗体都和RBD序列相关。

作为疫苗抗原的蛋白，其免疫原性和多肽高级结构有密切联系。基于CHO、293T等细胞的真核表达体系对于基因工程重组蛋白来说，是保证和野生型蛋白的多肽高级结构一致性最直接和有效方法；此外，真核表达系统一般来说比其它系统如大肠杆菌、昆虫细胞等表达系统表达量低，故其可用性主要取决于该重组蛋白在真核表达系统中的表达量。目前可以在实际生产中应用的提高真核表达水平方法有：1）针对转录阶段的表达载体的设计和改进，如采用高效的表达元件如启动子、增强子等；2）对翻译阶段的改进，重组蛋白本身的基因编码序列优化，包括密码子偏性优化；3）对宿主细胞优化，包括高效表达位点定位和靶向重组；4）细胞大规模培养工艺优化。

综上，如何提供一种高效表达的新型冠状病毒RBD核苷酸序列并对其进行表达应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种新型冠状病毒RBD核苷酸序列、优化方法与应用。通过改进翻译阶段来达到提高表达量目的。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种新型冠状病毒RBD核苷酸序列优化方法，包括如下步骤：

（1）在野生型新型冠状病毒RBD核苷酸序列的基础上做如下优化，得到初步优化新型冠状病毒RBD核苷酸序列：

（11）在5’端编码序列全长1/9~1/2部分采用低GC含量的同类氨基酸密码子替换原密码子，使上游240bp序列中GC含量低于40%；

（12）在3’端编码序列全长1/9~1/2部分采用高GC含量的同类氨基酸密码子替换原密码子，使下游240bp序列中GC含量高于50%；

（13）分析宿主细胞密码子偏性并应用于编码序列的密码子优化；

（14）在野生型新型冠状病毒RBD核苷酸序列前插入核苷酸序列：GTTAGATTCCCA；

所述野生型新型冠状病毒RBD核苷酸序列如下：