[发明专利]一种蜡样芽孢杆菌实时荧光PCR检测方法及应用

说明书

本发明涉及基于MGB探针的实时荧光PCR反应快速检测体系对8种蜡样芽孢杆菌进行检测。本发明以8种蜡样芽孢杆菌的wzm基因为靶基因，设计并筛选了针对每一个血清型的Taqman特异性引物及MGB探针，并建立了实时荧光PCR检测方法。具有对食品中常见致病菌‑蜡样芽孢杆菌全部菌株进行检测的技术手段。利用本发明提供的方法可以准确、快速、灵敏地对8种蜡样芽孢杆菌菌株进行分子生物学检测。

技术领域

本发明属于细菌检测方法技术领域，涉及用于蜡样芽孢杆菌全部8种菌株的实时荧光PCR检测方法及应用。

背景技术

蜡样芽孢杆菌是一种兼性厌氧型革兰氏阳性菌，广泛存在于土壤﹑水﹑空气﹑动物肠道中，与人类关系密切。由于蜡样芽孢杆菌是引起食物中毒的常见细菌，寻找一种方法准确鉴定与检测此菌对于食品安全有重要意义。

细菌的血清型与致病性密切相关，同一种内不同血清型细菌的致病性往往存在着很大差异。血清学分型自上世纪30年代开始被广泛使用，至今已有超过80年的历史，可在种/属内将细菌进一步分类，是一种重要的细菌鉴定方法，目前，血清学鉴定方法是使用最为普遍的致病菌鉴定和溯源方法。传统血清学鉴定方法虽被广泛使用，但仍存在诸多缺陷。主要包括：建立血清学分型系统的工作繁琐、周期长；血清的生产和质控较为困难；血清学鉴定的实验过程耗时较长（2-6天）等。

细菌表面多糖抗原主要包括O多糖（O抗原）、普通抗原（CA）、胞外多糖抗原、芽孢、以及荚膜多糖（K抗原）等。基于上述表面多糖抗原的多样性，细菌可被分为不同的血清型。同一细菌不同血清型的O抗原多样性，是由于编码合成O抗原的各种酶的基因的遗传多样性决定的，这些基因往往成簇地位于基因组上的固定位点，被称作O抗原基因簇。

TaqMan-MGB实时荧光PCR（Real-time fluorescence PCR）技术原理是，将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光。随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，即可表征检测样品的类型和含量。

TaqMan荧光探针是一种寡核苷酸探针，其 5' 末端携带荧光基团，如FAM、TET、VIC、HEX等， 3' 端携带淬灭基团，如TAMRA、BHQ等。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq 酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

TaqMan-MGB 探针是近年来在 TaqMan探针的基础上改进的一种新技术，它在探针3′ 端增加了MGB分子，这种物质能够提高探针的退火温度( Tm值) ，从而使它能够分辨 1个碱基的差别，完全配对，有荧光信号；只要有一个碱基不匹配，就没有信号。探针的设计首先为15-30 nt长度，Tm为68-70 ℃。 探针由AuGCT Biotechnology Corporation（中国北京）合成，分别在 5' 和 3' 末端具有6-羧基荧光素（FAM）和小沟结合（MGB）部分。引物的长度约为25 nt ，Tm在55-60 ℃之间。 产生的PCR产物在50-200 bp之间。 引物由Invitrogen（中国上海）合成。 如果正向引物的3'末端距离探针的5' 末端1-20 nt（通常为10 nt或更少），则可能更好。