[发明专利]一种用于检测ACE2基因多态性的探针、引物及试剂盒

说明书

本发明提供了一种用于检测ACE2基因多态性的探针，该探针的序列如SEQ ID NO.:1所示，或者在SEQ ID NO.:1的序列两端加以基团修饰。本发明还提供了一种用于检测ACE2基因多态性的引物，该引物的序列如SEQ ID NO.:2和SEQ ID NO.:3所示。本发明的用于检测ACE2基因多态性的探针和引物，在检测ACE2基因多态性时，具有灵敏度高、特异性好、快速、高通量检测等优点。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体的涉及一种用于检测ACE2基因多态性的探针、引物及试剂盒。

背景技术

ACE2（angiotensin I converting enzyme 2）基因编码的蛋白属于二肽基羧二肽酶的血管紧张素转换酶家族，与人血管紧张素1转换酶具有相当的同源性。这种分泌蛋白催化血管紧张素I裂解为血管紧张素1-9，血管紧张素II裂解为血管扩张剂血管紧张素1-7。该基因的器官和细胞特异性表达表明，它可能在调节心血管和肾功能以及生育能力方面发挥作用。此外，编码的蛋白是人冠状病毒SARS和HCoV-NL63尖峰糖蛋白的功能性受体。

目前普遍应用的突变检测方法为DNA直接测序法，PCR产物直接进行DNA序列分析，可以明确突变位点，但存在费时费力，成本较昂贵，不适用于对大量样本进行检测等缺点。因此，需要开发一种适合大批量样本检测的方法。

发明内容

本发明的目的首先在于提供一种用于检测ACE2基因多态性的探针，该探针的序列如SEQ ID NO.:1所示，或者在SEQ ID NO.:1的序列两端加以基团修饰；

其中修饰基团为：5′的修饰基团为荧光基团，如CY5；3′的修饰基团为淬灭基团，如BHQ2；

具体的说，本发明提供的用于检测ACE2基因多态性的探针为：5′-CY5-CCGAATTAGTAGCNTACCTGGTTCGG-BHQ2-3′；

其中N为变异碱基，具体为CT；

所述的探针包括环序列和茎序列，其中环序列为第6~21bp（5′-CCGAATTAGTAGCNTACCTGGTTCGG-3′），其两侧是两个反向互补的茎序列，茎序列为（5′-CCGAA……TTCGG-3）。

该探针的设计原理为：根据ACE2基因多态性rs2285666，设计探针和引物，需要保证在退火温度下DNA模板不存在时，探针呈茎环状态。探针所采用的淬灭基团为BHQ2，其淬灭空间范围很小，搭配短发射波长的荧光基团，如CY5，只有当分子信标呈茎环结构时，荧光才会被很好地淬灭。环序列与靶DNA序列互补时，确定最佳PCR引物为40-45 bp大小，PCR产物长度100-150 bp。

本发明还提供了一种用于检测ACE2基因多态性的引物，该引物的序列如SEQ IDNO.:2（引物1）和SEQ ID NO.:3（引物2）所示：

引物1 5′-AGGTGACACTATAGAATATGAAACACACATATCTGCAATCA-3′

引物2 5′-GCAAGCCCTCACGTAGCGAACTGGAAAAGTTTGTAACCCAGA-3′。

本发明还提供了一种用于检测ACE2基因多态性的试剂盒，该试剂盒包含如上所述的探针和/或引物。

该试剂盒还包含还有Taq酶、dNTP、和/或Mg²⁺，以及使用说明书。

本发明还提供一种了用于检测ACE2基因多态性的方法该方法包括如下步骤：

（1）采集样本，抽提DNA；

（2）应用上述探针和引物进行荧光定量PCR反应；

（3）应用PCR仪配套软件分析结果，根据扩增曲线，规定合适基线和阈值，基于形成的杂交峰所显示的Tm值差异展现不同的基因型；

其中Tm值58℃时为野生型，Tm值50℃时为突变型。