[发明专利]KGF蛋白外泌体的制备方法、KGF蛋白外泌体干粉、应用及一种毛发护理剂

权利要求书

1.一种KGF蛋白外泌体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括，构建具有KGF过表达能力的细胞株，再培养所述细胞株，从培养液中分离得到KGF蛋白外泌体，所述具有KGF过表达能力的细胞株中包含至少两个具有不同插入序列的重组质粒，所述插入序列包括dCas9-转录激活子序列或引导序列，所述转录激活子序列包括序列SEQ ID No.13，所述引导序列编辑gRNA序列，所述引导序列包括由单链DNA退火得到的双链DNA；

所述单链DNA的序列为以下六组序列中的一组：

第一组序列包括SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；

第二组序列包括SEQ ID No.3和SEQ ID No.4；

第三组序列包括SEQ ID No.5和SEQ ID No.6；

第四组序列包括SEQ ID No.7和SEQ ID No.8；

第五组序列包括SEQ ID No.9和SEQ ID No.10；

第六组序列包括SEQ ID No.11和SEQ ID No.12。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述细胞株包括干细胞。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述干细胞包括iPSC干细胞。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述重组质粒包括含有引导序列质粒和含有dCas9-转录激活子质粒。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述重组质粒包括质粒lentiGuide-Hygro-mTagBFP2-gRNA-A和质粒lenti-EF1a-dCas9-VPR-Puro。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述质粒lentiGuide-Hygro-mTagBFP2-gRNA-A的构建方法包括设计合成gRNA序列，根据gRNA序列合成单链DNA序列，经退火后得到对应的双链DNA序列，该双链DNA序列在连接酶的作用下，连接于酶切后的质粒lentiGuide-Hygro-mTagBFP2上，得到重组质粒lentiGuide-Hygro-mTagBFP2-gRNA-A。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述重组质粒还经过病毒包装。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述病毒包装选用293T细胞。

9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述重组质粒在进行病毒包装前还需要进行重组质粒的扩增和/或鉴定。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述重组质粒的扩增包括将重组质粒转化进DH5α感受态细胞中进行培养；所述重组质粒的鉴定包括提取扩增后的重组质粒进行基因测序，并确定测序结果中包括引导序列或转录激活子序列。

11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，在培养所述DH5α感受态细胞之前还包括细胞株的筛选。

12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述细胞株的筛选包括，采用含有细胞毒素的培养基对含有重组质粒的细胞株进行培养，所述的细胞毒素与重组质粒具有的抗性相对应。

13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述细胞毒素包括嘌呤霉素和/或潮霉素B。

14.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的KGF蛋白外泌体采用离心的方法从细胞株培养液中分离获得KGF蛋白外泌体，包括首先离心去除细胞株，而后增大离心力到48000rpm以上，再次离心得到KGF蛋白外泌体。