[发明专利]一种利用多底物代谢特性微生物连续制备甲醇的方法

说明书

本发明属于甲醇制备技术领域，涉及一种利用多底物代谢特性微生物连续制备甲醇的方法，其使用兼养型甲烷氧化菌制备甲醇，制备时，向兼养型甲烷氧化菌提供两种底物：甲烷无菌混合气和多碳化合物，甲烷无菌混合气中的甲烷进入微生物细胞内，被甲烷单加氧酶转化为甲醇，多碳化合物进入微生物细胞内，被多碳代谢途径同化以维持兼养型甲烷氧化菌细胞正常生长代谢和生物质合成，对菌液OD值和甲醇产量进行测试的结果显示：甲烷无菌混合气和乙酸作双底物时，细菌生长速度显著提高，甲醇产量显著提高，原因是在乙酸存在的条件下，细菌既能够在MDH抑制剂作用下氧化甲烷生产甲醇，又能够利用乙酸维持细菌细胞的正常生长代谢，使得细菌能够连续生产甲醇。

技术领域：

本发明属于甲醇制备技术领域，具体涉及一种利用多底物代谢特性微生物连续制备甲醇的方法，多底物代谢特性微生物在利用多碳化合物进行生长代谢的同时，对甲烷进行高效催化实现甲醇的连续制备。

背景技术：

甲醇(Methanol)：结构最为简单的饱和一元醇，又称羟基甲烷，是一种有机化合物，属于重要的化工原料和优质燃料，应用广泛，用于制造氯甲烷、甲胺和硫酸二甲酯等多种有机产品，生产甲醛、醋酸，制造甲酸甲酯、甲胺和生长促进剂，合成碳酸二甲酯、乙二醇和甲醇蛋白，用作清洗去油剂、分析试剂，溶解无机盐，掺入汽油作替代燃料，生产二甲醚等。工业上，通常采用一氧化碳加压催化加氢制备甲醇，但是，其反应条件苛刻、工序繁复、成本较高。除此之外，利用甲烷氧化菌制备甲醇也是行之有效的办法，其在实验室条件下可以得到较为理想的甲醇产量。甲烷氧化菌是一类利用甲烷作碳源和能源进行生长的微生物，当甲烷进入细菌细胞内，甲烷单加氧酶利用分子氧催化甲烷转化为甲醇，甲醇进一步在甲醇脱氢酶(MDH)的作用下转化为甲醛，甲醛再进入后续代谢途径被转化为生物质或二氧化碳。在此过程中，甲醇是甲烷氧化菌生长代谢的中间产物，通过添加MDH抑制剂(MgCl₂、NaCl、EDTA、磷酸等)可以阻断MDH对甲醇的进一步氧化，使甲醇得到积累。与传统的化学物质制备方法相比，微生物制备化学物质具备反应条件温和、简单易行、成本低、环境友好等优势，应用前景良好。例如：中国专利201910333029.4公开的一种生产2,5-呋喃二甲醇的方法，包括：利用阴沟肠杆菌对5-羟甲基糠醛进行生物催化处理，以便获得2,5-呋喃二甲醇，利用所述阴沟肠杆菌对含有5-羟甲基糠醛的培养基进行发酵培养，所述培养基中5-羟甲基糠醛的含量为5～10g/L，所述生物催化处理包括：将所述阴沟肠杆菌接种于培养基中，进行预培养，以便获得预培养液；以及向所述预培养液中加入5-羟甲基糠醛，继续进行培养，以便获得2,5-呋喃二甲醇，所述培养基中含有10～30g/L的葡萄糖，所述阴沟肠杆菌预先经过活化处理，以便获得种子液，将所述种子液以3～6体积％接种于所述培养基中；任选地，所述预培养的时间为4～8小时；任选地，所述预培养和培养分别独立地在30～40℃的温度及100～200rpm的转速下进行；任选地，所述培养基包括：1～5g/L的(NH4)2SO4，0.5～1g/L的K2HPO4，0.1～0.5g/L的KH2PO4，0.5～2g/L的酵母浸粉，0.1～0.5g/L的MgSO4·7H2O，0.5～1.5mL/L的微量元素，1～5mL/L的FeSO4溶液，pH6.5，进行所述培养过程中，补加5-羟甲基糠醛，进行所述培养过程中，流加5-羟甲基糠醛至培养液中5-羟甲基糠醛终浓度维持在0～3g/L；或者进行所述培养过程中，当培养液中5-羟甲基糠醛的浓度为0～3g/L时，补加终浓度为5～6g/L的5-羟甲基糠醛溶液；中国专利201110419992.8公开的一种利用微生物催化制备(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇的方法，步骤如下：(1)湿菌体的培养：培养基组成以g/L计为：葡萄糖5－50，酵母膏3－30，磷酸二氢钾1－10，七水合硫酸镁0.2－2，pH4－9，发酵培养1－5天，发酵液过滤获得湿菌体；(2)配置反应体系：以4-氯苯基-(吡啶-2-基)-甲酮为底物，用不同分子量的PEG与不同无机盐溶液配制成的各种双水相反应体系，底物浓度为0.5－20g/L，葡萄糖浓度10－100g/L；(3)酶转化反应：在反应体系中加入CCTCC NO：M2011385湿菌体50-250g/L，于25-45℃进行酶反应，反应时间为3-72h；(4)转化液后处理：用乙酸乙酯萃取转化液，将萃取获得的有机相蒸发回收溶剂，采用硅胶柱层析进一步分离纯化，再干燥脱水，蒸发回收溶剂，获得无色油状液体产物(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇；中国专利200710046918.X公开的一种浊点系统中微生物转化合成L－苯基乙酰基甲醇的方法，包括以下步骤：第一步，在培养基中利用微生物发酵获得具有生物活性的微生物细胞作为微生物转化的生物催化剂；第二步，利用第一步得到的微生物细胞构建浊点系统，并设置浊点系统中微生物转化的操作参数，包括乙醛、底物苯甲醛、微生物细胞和葡萄糖的量以及pH值，然后在设置的操作条件下实现浊点系统中的微生物转化，得到L－苯基乙酰基甲醇；所述浊点系统，是非离子表面活性剂TritonX－114和TritonX－45按照体积比1：0.1－0.4混合，然后与水溶液混合成浊点系统，其中混合表面活性剂所占的体积分率为10-14％；或者是表面活性剂TritonX－100与聚乙二醇混合后与100ml水溶液形成浊点系统，其中表面活性剂与聚乙二醇所占的体积分率为10-20％；所述水溶液，其100ml中含有：蛋白胨2g、酵母粉2g、乙醛0.4－1ml、微生物细胞2-11g、苯甲醛0.3-1.2ml、葡萄糖1.2-6g，pH控制在4-6之间。在现有技术中，微生物制备甲醇的技术仅在实验室条件下可以开展批次试验，但是，在实际生产中，并不能实现大规模连续化制备，原因在于：甲醇生产和微生物细胞同化共用了一条途径，MDH抑制剂在抑制MDH活性时，在短时间内能够使中间产物甲醇得到积累，但是，同时也极大地干扰了微生物对甲醇的进一步同化，使其无法完成后续代谢途径，影响微生物的生长代谢，以至于无法长期、稳定和持续生产甲醇，大大限制了微生物制备甲醇技术的大规模工业化应用。