[发明专利]一种第四代CAR-T细胞及其应用

说明书

本发明提供了一种第四代CAR‑T细胞及其应用，所述第四代CAR‑T细胞表达特异性结合抗原的嵌合抗原受体、分泌型IL‑7和NFAT调控型CCL19；所述IL‑7的信号肽为IL‑10信号肽；所述CCL19的启动子为NFAT调控启动子。本发明通过将IL‑7的原有信号肽改变为T细胞分泌蛋白IL‑10的信号肽，并采用NFAT调控型启动子作为CCL19的启动子，使得CAR‑T细胞能够将IL‑7分泌到胞外，并条件性表达CCL19，不仅促进了CAR‑T细胞的增殖，而且最大程度招募免疫细胞到肿瘤内部，显著提高了CAR‑T的抗肿瘤功效。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种第四代CAR-T细胞及其应用。

背景技术

嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigen receptor T cell，CAR-T)免疫治疗是通过在T细胞膜上表达特异性识别并结合肿瘤抗原的嵌合抗原受体分子，诱导T细胞活化，从而实现对肿瘤细胞特异性杀伤的一种技术。这项技术是目前最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一，在白血病治疗领域已取得了巨大突破。

但是，在实体瘤的治疗上，此技术仍然存在诸多问题。科研人员正在努力试图对CAR-T疗法进行改进和优化，通过提高嵌合抗原受体的亲和力、敲除CAR-T细胞的PD-1等方法提高CAR-T对实体瘤的治疗效果。

CN109153989A构建的CAR-T细胞可以持续分泌IL-7和CCL19，不仅提高了CAR-T细胞的体外扩增能力，而且招募到更多外周血循环T细胞和树突状细胞到肿瘤内，增强了CAR-T细胞的抗肿瘤效果。但是，当CAR-T细胞留存在脾脏、淋巴结等免疫细胞较多的地方时，分泌的CCL19会将外周血循环T细胞和树突状细胞招募到特定部位，减少血液循环中的T细胞和树突状细胞的比例，从而降低了T细胞和树突状细胞被招募到肿瘤内的几率。

因此，构建一种新型CAR-T细胞，不仅能分泌IL-7和CCL19，而且能最大程度将外周血免疫细胞招募到肿瘤内部，在实体瘤的治疗领域具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种第四代CAR-T细胞及其应用，通过将IL-7的信号肽优化为T细胞分泌蛋白IL-10的信号肽，并将CCL19的持续性分泌优化为NFAT调控性分泌，显著提高了CAR-T细胞的抗肿瘤效果，并降低了炎症副反应发生几率。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种第四代CAR-T细胞，所述第四代CAR-T细胞表达特异性结合抗原的嵌合抗原受体、分泌型IL-7和NFAT调控型CCL19；

所述IL-7的信号肽为IL-10信号肽；

所述CCL19的启动子为NFAT调控启动子。

本发明中，将IL-7信号肽替换为T细胞分泌蛋白IL-10的信号肽，使得CAR-T细胞将外源性IL-7分泌到胞外，IL-7增强了T细胞的体外增殖能力；采用NFAT调控启动子调控T细胞对CCL19的表达，当CAR-T细胞处于静息状态时，CCL19不表达，当CAR-T细胞识别肿瘤抗原被激活后，NFAT调控启动子3×NFAT-RE-IL-2启动对CCL19的转录和翻译，CCL19开始表达，实现了外周血免疫细胞最大程度被招募到肿瘤内部的效果。

优选地，所述IL-10信号肽包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:1：MHSSALLCCLVLLTGVRA。

优选地，所述IL-7包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:2：