[发明专利]一种PIVKA-II抗原表位肽和抗PIVKA-II单克隆抗体及其应用

说明书

本发明公开了一种PIVKA‑II抗原表位肽、抗PIVKA‑II单克隆抗体及其应用，本发明中的抗原表位肽基于在PIVKA‑II N末端特异性序列的基础上添加了特定亲水序列，增强了PIVKA‑II抗原决定簇的暴露性。基于上述抗原表位肽，本发明中的单克隆抗能准确识别结合PIVKA‑II，而对凝血酶原无结合，具有良好的稳定性能，可作为诊断试剂的关键性原材料；本发明也提供了使用上述单克隆抗体的PIVKA‑Ⅱ化学发光免疫分析检测试剂盒及其制备方法。

技术领域

本发明涉及免疫学和生物医药工程技术领域，具体涉及PIVKA-II抗原表位肽构建、抗人PIVKA-Ⅱ单克隆抗体筛选和扩大生产及所述抗体在体外诊断试剂盒和的应用。

背景技术

肝癌的定性诊断以血清中肿瘤标志物AFP水平为主；但研究表明AFP特异性和灵敏度较低，不建议作为单独的诊断指标，需要与其他诊断方法联合使用以提升诊断的可靠性。

而新的肝癌标志物PIVKA-Ⅱ具有较高的诊断特异性，得到了越来越多的关注。PIVKA-Ⅱ是维生素K缺乏诱导的蛋白-II(Protein ind uced by vitamin Kabsence-II)的英文缩写，又被称为异常凝血酶原，是一种与血液凝结、具有与凝血酶原类似结构的糖蛋白。凝血酶原是一种由622个氨基酸残基组成的蛋白质，位于氨基末端附近的10个谷氨酸残基被γ-羧基化形成γ-羧基谷氨酸(Gla)残基，但当机体处于肝细胞损伤、肝功能衰竭、维生素K缺乏、维生素K拮抗或者肝癌发生时，相应羧基化受到干扰导致10个谷氨酸残基部分或全部缺少羧基化，而这种修饰异常蛋白被称为异常凝血酶原DCP或PIVKA-Ⅱ。

PIVKA-Ⅱ在1984年由Liebeman首次作为肿瘤标志物进行了相关研究。最近几年PIVKA-Ⅱ在肝癌诊断检测领域得到了关注，《亚太肝病学会》、《日本肝病学会》指南中推荐将其用于筛查高危人员、辅助肝癌诊断、监测治疗疗效以及预后和复发的预测。研究发现，在良性肝病患者如慢性肝炎、酒精性肝病或肝硬化中PIVKA-Ⅱ的N末端羧基化数量往往多于5个，而在肝细胞癌症患者中相应羧基化数量少于4个。

由于PIVKA-Ⅱ和正常凝血酶的高度相似性以及羧基化位点的多变性，导致了目前能特异性识别和高亲和力结合PIVKA-Ⅱ的单克隆抗体非常稀少。目前国内外只有少数几家公司能提供PIVKA-Ⅱ单克隆抗体，如Fujiebio使用的MU-3和Abbott ARCHITECT使用的3C10两株抗体。因而开发性能优异的、具有自主产权的PIVKA-Ⅱ单克隆抗体对于提升PIVKA-Ⅱ诊断试剂性能、提高检测可靠性、肝癌早发现早治疗具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术中PIVKA-Ⅱ和正常凝血酶的高度相似性以及羧基化位点的多变性，导致了目前能特异性识别和高亲和力结合PIVKA-Ⅱ的单克隆抗体非常稀少的问题，提供一种高特异性和强亲和力的抗人LP-PLA2蛋白的单克隆抗体及其应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

一种PIVKA-II抗原表位肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该多肽序列基于PIVKA-II第11-26氨基酸序列，所用谷氨酸均未γ-羧基化，且在末端增加了独特的8个氨基酸序列以增加免疫性。利用上述免疫多肽，本发明提供了一种亲和力高、特异性强、稳定性好的单克隆抗体，并建立其基于化学发光法PIVKA-Ⅱ检测试剂盒从而实现对其浓度的准确检测。

高特异性和强亲和力的抗人PIVKA-Ⅱ单克隆抗体PV-Ab1，单克隆抗体PV-Ab1重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。单克隆抗体PV-Ab1为可特异性识别结合PIVKA-Ⅱ的氨基末端缺少羧基化修饰表位的单克隆抗体。

3、一种包含有权利要求2所述的单克隆抗体PV-Ab1的试剂盒。