[发明专利]一种基于纯DNA功能水凝胶的有害金属离子检测方法

权利要求书

1.一种基于纯DNA功能水凝胶的有害金属离子检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：设计两条DNA单体序列E1链和S1链，分别包含目标金属离子的DNAzyme和酶切底物，并至少含有三段互补片段；所述目标金属离子为铅离子；所述两条DNA单体序列分别为：

S1链：

5’- TATCAGATTCGATTTTTT CACTAT/rA/GGAA GAGATGTTTTTGTCGGTAACCAG-3’；

E1链：

5’-TCGAATCTGATATTT TT CATCTCTTCTCCGA GCCG GTCGAA ATAGTGATTTTTCTGGTTACCGAC-3’；

步骤2：将设计的两条单体序列混合杂交制备纯DNA水凝胶；该步骤具体如下：

步骤2a：将两条单体序列各自按1.5 mM的理论浓度溶解于缓冲液中，并于35 ℃条件下充分溶解；所述缓冲液为含100 mM NaCl的50 mM HEPES缓冲液，pH为7.0；

步骤2b：采用微量核酸蛋白测定仪中的寡核苷酸分析程序标定真实浓度；

步骤2c：将经过定量的DNA序列，按照E1链与S1链摩尔比1:1，在统一规格的PCR管中，用缓冲液一步混合配制10 μL体积的终浓度为0.3~0.6 mM的DNA水凝胶；

步骤2d：将DNA水凝胶置于PCR仪中，首先升温至60~70 ℃并恒温，用漩涡混合仪将粘稠的DNA水凝胶混匀；

步骤2e：将DNA水凝胶重新置于PCR仪中，升温至65~75 ℃并恒温5 min，然后以0.45℃/min的速率降至10 ℃进行退火；

步骤2f：将制备好的DNA水凝胶置于室温保存；

步骤3：将目标金属离子溶液与制备的纯DNA水凝胶反应30 min~6 h，使DNA水凝胶骨架中特定的DNAzyme被激活并切断底物序列，破坏水凝胶结构，释放出核酸碎片，然后利用核酸碎片直接测量上清溶液中DNA的本征紫外吸收信号，进而实现对目标金属离子浓度的检测；该步骤具体如下：

步骤3a：将80 μL 0~1000 nmol/L不同浓度的Pb²⁺标准液加入10 μL的DNA水凝胶中，于25 ℃恒温条件下反应；

步骤3b：每隔1 h从PCR管上清中取1~2 μL，用微量核酸蛋白测定仪测试260 nm处吸光度。

2.一种基于纯DNA功能水凝胶的有害金属离子检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：设计两条DNA单体序列E2链和S2链，分别包含目标金属离子的DNAzyme和酶切底物，并至少含有三段互补片段；所述目标金属离子为铀酰离子；所述两条DNA单体序列分别为：

S2链：

5’- GAAATGGATGGG TTTTTTT ACTCACTAT/rA/G GA AGAGATGGACGTG TTTTTTTGACAAGAATAAG -3’；

E2链：

5’- CCCATCCATTTC TTTTTTT CACGTCCATCTCT GCAGTCGGGTAGTTAAACC GACCTTCAGACATAGTGAGT TTTTTTT CTTATTCTTGTC -3’；

步骤2：将设计的两条单体序列混合杂交制备纯DNA水凝胶；该步骤具体如下：

步骤2a：将两条单体序列各自按1.5 mM的理论浓度溶解于缓冲液中，并于35 ℃条件下充分溶解；所述缓冲液为含100 mM NaCl的50 mM MES缓冲液，pH为5.5；

步骤2b：采用微量核酸蛋白测定仪中的寡核苷酸分析程序标定真实浓度；

步骤2c：将经过定量的DNA序列，按照E2链与S2链摩尔比1:1，在统一规格的PCR管中，用缓冲液一步混合配制10 μL体积的终浓度为0.3~0.6 mM的DNA水凝胶；

步骤2d：将DNA水凝胶置于PCR仪中，首先升温至60~70 ℃并恒温，用漩涡混合仪将粘稠的DNA水凝胶混匀；

步骤2e：将DNA水凝胶重新置于PCR仪中，升温至65~75 ℃并恒温5 min，然后以0.45℃/min的速率降至10 ℃进行退火；

步骤2f：将制备好的DNA水凝胶置于室温保存；

步骤3：将目标金属离子溶液与制备的纯DNA水凝胶反应30 min~6 h，使DNA水凝胶骨架中特定的DNAzyme被激活并切断底物序列，破坏水凝胶结构，释放出核酸碎片，然后利用核酸碎片直接测量上清溶液中DNA的本征紫外吸收信号，进而实现对目标金属离子浓度的检测；该步骤具体如下：

步骤3a：将80 μL 0~1000 nmol/L不同浓度的铀酰标准液加入10 μL的DNA水凝胶中，于25 ℃恒温条件下反应；

步骤3b：每隔1 h从PCR管上清中取1~2 μL，用微量核酸蛋白测定仪测试260 nm处吸光度。