[发明专利]一种呼吸道病原微生物检测用引物及其应用

权利要求书

1.一套呼吸道病原微生物检测用引物，其由以下序列所示的引物组成：

IAV-F：GACAAGACCRATYCTGTCACCTYTGACTAAGGG

IAV-R：ATTGAGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTACGCTGC

IBV-F：GACTACCCTGGTCAAGACCGCCTAAACAGACTAA

IBV-R：TGTCATCAAGGCACCTTCCTGGTGTTAGAGGGTAA

2019-nCoV-1F：GGTAATGCAACAGAAGTGCCTGCCAATTCAACTCT

2019-nCoV-1R：AACGATTGTGCATCAGCTGACTGAAGCATGGGTTC

2019-nCoV-2F：GTCGGCCCCAAGGTTTACCCAATAATACTGCGTC

2019-nCoV-2R：TGAGGAAGTTGTAGCACGATTGCAGCATTGTTAGC。

2.根据权利要求1所述的呼吸道病原微生物检测用引物，其特征在于，所述引物用于检测甲型流感病毒、乙型流感病毒和新型冠状病毒。

3.一种呼吸道病原微生物的检测方法，包括使用等温扩增检测呼吸道病原微生物的存在；其特征在于，所述检测方法包括：

提取获得目标微生物DNA/RNA；

使用如权利要求1或2所述的引物对所述目标微生物DNA/RNA进行RPA扩增，得到扩增产物；

检测所述扩增产物。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述RPA扩增体系包括：

25μL的2x反应缓冲液；

0.7μL的摩尔浓度为2.5mM的dNTP；

5.5μL水；

5μL的10x基本酶混合液；

1.2μL的摩尔浓度为10μM的所述引物IAV-F和IAV-R；

1.2μL的摩尔浓度为10μM的所述引物IBV-F和IBV-R；

1.2μL的摩尔浓度为10μM的所述引物2019-nCoV-1F和2019-nCoV-1R；

1.2μL的摩尔浓度为10μM的所述引物2019-nCoV-2F和2019-nCoV-2R；

2.5μL的20x核心反应混合液；

1μL的50x反转录酶；

2.5μL的摩尔浓度为280mM的MgOAc；

3μL的所述目标微生物DNA/RNA。

5.根据权利要求3或4所述的检测方法，其特征在于，使用如权利要求1或2所述的引物对所述目标微生物DNA/RNA进行RPA扩增，包括：

将25μL的2x反应缓冲液、0.7μL的摩尔浓度为2.5mM的dNTP、5.5μL水、5μL的10x基本酶混合液涡旋混合，得到第一预混液；

将所述第一预混液与2.5μL的20x核心反应混合液混合，离心，后添加1μL的50x反转录酶，再次离心，得到第二预混液；

将所述第二预混液与1.2μL的摩尔浓度为10μM的所述引物IAV-F和IAV-R、1.2μL的摩尔浓度为10μM的所述引物IBV-F和IBV-R、1.2μL的摩尔浓度为10μM的所述引物2019-nCoV-1F和2019-nCoV-1R、1.2μL的摩尔浓度为10μM的所述引物2019-nCoV-2F和2019-nCoV-2R涡旋混合，得到第三预混液；

将2.5μL的摩尔浓度为280mM的MgOAc、3μL的所述目标微生物DNA/RNA与所述第三预混液混合，离心，后于温度为42℃下孵育20min。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述将2.5μL的摩尔浓度为280mM的MgOAc、3μL的所述目标微生物DNA/RNA与所述第三预混液混合，离心，后于温度为42℃下孵育20min，包括：

将2.5μL的摩尔浓度为280mM的MgOAc、3μL的所述目标微生物DNA/RNA以保持分离的状态添加到试管盖上，经离心后落入包含有所述第三预混液的试管中，再次离心，后于温度为42℃下孵育20min。