[发明专利]一种新型冠状病毒SARS-CoV-2复制子、其构建方法及应用

权利要求书

1.一种新型冠状病毒SARS-CoV-2复制子，其特征在于，所述新型冠状病毒SARS-CoV-2复制子为带有单报告基因的SARS-CoV-2-GFP复制子或者带有双报告基因的SARS-CoV-2-GFP-Luc复制子，其中，所述SARS-CoV-2-GFP复制子包括如下元件：CMV启动子、5'非翻译区、去除NSP1蛋白的ORF1ab编码序列、tGFP编码序列、ORF8第238-366区间编码序列、核衣壳蛋白编码序列、3'非翻译区、丁肝病毒核酶编码序列和牛生长激素多腺苷酸化信号；所述SARS-CoV-2-GFP-Luc复制子包括如下元件：CMV启动子、5'非翻译区、去除NSP1蛋白的ORF1ab编码序列、tGFP编码序列、荧光素酶编码序列、杀稻瘟菌素抗性基因编码序列、ORF8第238-366区间编码序列、核衣壳蛋白编码序列、3'非翻译区、丁肝病毒核酶编码序列和牛生长激素多腺苷酸化信号。

2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒SARS-CoV-2复制子，其特征在于，所述CMV启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述5'非翻译区的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述去除NSP1蛋白的ORF1ab编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述tGFP编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述荧光素酶编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述杀稻瘟菌素抗性基因编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述ORF8第238-366区间编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述核衣壳蛋白编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述3'非翻译区的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述丁肝病毒核酶编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述牛生长激素多腺苷酸化信号的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

3.权利要求1或2所述的新型冠状病毒SARS-CoV-2复制子的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：制备复制子基因片段

步骤1.1：提取新型冠状病毒SARS-CoV-2的RNA，进行反转录聚合酶链式反应，得到cDNA；

步骤1.2：将CMV启动子和5'非翻译区通过基因合成后，进行PCR扩增，得到片段1；

步骤1.3：以步骤1.1得到的cDNA为模板，采用22对引物对，进行PCR扩增，分别得到片段2-片段22和片段25；

步骤1.4：以pCMV6-AN-GFP质粒为模板，进行PCR扩增，得到tGFP编码序列，即片段23；

步骤1.5：将杀稻瘟菌素抗性基因编码序列和ORF8第238-366区间编码序列通过基因合成后，进行PCR扩增，得到片段24；

步骤1.6：将3'非翻译区、丁肝病毒核酶编码序列和牛生长激素多腺苷酸化信号通过基因合成后，进行PCR扩增，得到片段26；

步骤1.7：分别PCR扩增杀稻瘟菌素抗性基因编码序列、PCR扩增ORF8第238-366区间编码序列，在PGL3载体上PCR扩增荧光素酶编码序列，再采用重叠延伸PCR反应，将杀稻瘟菌素抗性基因编码序列的PCR扩增产物、荧光素酶的编码序列的PCR扩增产物和ORF8第238-366区间编码序列的PCR扩增产物进行拼接，得到片段24-Luc；

步骤1.8：采用重叠延伸PCR反应，将步骤1.2的片段1、步骤1.3的片段2-片段22、步骤1.4的片段23、步骤1.5的片段24、步骤1.3的片段25和步骤1.6的片段26进行组装缝合，得到如下基因片段：F1-4、F5-8、F9-11、F12-13、F14-17、F18-19、F20-22、F23-24和F25-26；

步骤1.9：将步骤1.8得到的基因片段F1-4连接T载体，通过缺失突变，得到去掉NSP1的基因片段：F1-4：F1-4ΔNSP1；

步骤2：构建重组质粒

将步骤1得到的9个基因片段：F1-4ΔNSP1、F5-8、F9-11、F12-13、F14-17、F18-19、F20-22、F23-24和F25-26，与pYES1L线性化质粒载体一同在酵母细胞内进行重组，得到用于构建SARS-CoV-2-GFP复制子的重组质粒；

或者将步骤1得到的10个基因片段：F1-4ΔNSP1、F5-8、F9-11、F12-13、F14-17、F18-19、F20-22、F23、F24-Luc和F25-26，与pYES1L线性化质粒载体一同在酵母细胞内进行重组，得到用于构建SARS-CoV-2-GFP-Luc复制子的重组质粒；

步骤3：得到阳性重组酵母质粒

将步骤2得到的重组质粒进行鉴定，得到阳性重组酵母质粒；

步骤4：得到阳性复制子克隆

将步骤3得到的阳性重组酵母质粒，电转化大肠杆菌感受态，得到阳性复制子大肠杆菌单克隆；

步骤5：复制子质粒的大量提取和测序验证

将步骤4得到的阳性复制子大肠杆菌单克隆，进行大量提取和测序验证，即得到SARS-CoV-2-GFP复制子或者SARS-CoV-2-GFP-Luc复制子。