[发明专利]一种细胞膜包覆纳米酶的方法

说明书

本发明公开了一种细胞膜包覆纳米酶的方法。将几种不同细胞裂解，提纯细胞膜，并包覆在具有过氧化氢酶活性的双层中空硅酸锰表面，增强纳米酶在体内的靶向性，延长体内循环时间，从而使纳米酶有效在肿瘤部位富集，催化过氧化氢产生氧气，缓解肿瘤乏氧。该细胞膜包覆的纳米酶生物相容性好，为精准治疗提供思路，有较大临床应用前景。

技术领域：

本发明属于纳米材料技术领域，涉及一种细胞膜包覆纳米酶的方法。

背景技术：

乏氧是大多数实体瘤的共同特征，这主要是由于癌细胞的快速增殖大量消耗氧气和肿瘤中微血管系统导致氧气摄取效率低下所引起的。乏氧不仅会降低抗癌治疗的疗效，例如化学疗法，光动力疗法和放射疗法，也增加了肿瘤的浸润和转移，导致癌症患者死亡。此外，乏氧条件下促进了巨噬细胞从具有病原体清除和抗致瘤特性的M1型到具有促血管生成和促肿瘤生长的M2型极化，促使免疫系统对肿瘤细胞的攻击减弱。因此，缓解肿瘤乏氧至关重要。

传统医学方法已尝试通过高压氧吸入来增加肿瘤氧水平。然而，肿瘤部位低效的微血管系统阻碍了高压血液的氧合作用，过量吸入氧的潜在毒性也阻碍了高压氧吸入的临床应用。已经报道了一些纳米酶可以通过催化肿瘤部位的过氧化氢产生氧气促进肿瘤氧合，如二氧化锰。与天然酶相比，纳米酶具有较高的稳定性、可调节的酶活性以及较低的生产成本，在生物医用方面展现出了良好的应用前景。

然而，人工合成的纳米酶作为外来物质，一旦注射到体内，将会被快速清除，从而缩短了循环时间并限制了治疗效果，尽管可以通过聚合物对其进行表面修饰来改善，但会引起不同程度的免疫反应。此外，纳米酶虽然可以通过EPR效应被动靶向到肿瘤位点，但递送效率只有0.7％。因此，实现纳米材料的免疫逃逸、延长纳米材料半衰期以及增强其肿瘤靶向性至关重要。细胞膜表面存在功能性蛋白，利用细胞膜包覆可以延长纳米粒子的血液循环半衰期以及避免其被免疫系统识别，增强纳米酶主动靶向性。

发明内容：

为了解决纳米酶在体内靶向性差、半衰期短的问题，本发明的目的是提供一种细胞膜膜包被纳米酶双层中空纳米硅酸锰的方法。为了实现所述目的，本发明首先利用低渗溶液或冻融循环裂解细胞提取细胞膜，再通过挤压的方式将纳米酶包裹进生物膜当中，最终能够形成均一的膜包覆的纳米酶。

本发明的技术方案如下：

一种细胞膜包覆纳米酶的方法，具体步骤如下：

巨噬细胞细胞膜提取：将RAW 264.7巨噬细胞重悬于Tris-镁缓冲液(pH 7.4，Tris和MgCl₂的质量比为1：12.72)，浓度为2.5×10⁷个/mL，并通过不带聚碳酸酯膜的Avestin脂质体挤出机挤出以破坏细胞。将细胞匀浆与1M蔗糖混合至终浓度0.25M蔗糖，然后在2000g和4℃下离心10分钟。收集上清液，并在3000g和4℃下进一步离心30min以收集细胞膜。细胞膜用4℃的Tris-镁缓冲液洗涤，并在3000g和4℃下离心30min收集。重悬于磷酸盐缓冲溶液中，RAW 264.7巨噬细胞与磷酸盐缓冲溶液的比例为2.5×10⁷个：1mL。将获得的细胞膜与双层中空硅酸锰混合，细胞膜悬液体积与双层中空硅酸锰的质量比为1mL:200μg，通过孔径为200nm的聚碳酸酯膜，至少25次，离心收集细胞膜包覆的纳米酶，离心力为8950g，离心时间为10min，室温下进行。

本发明合成的细胞膜包覆的纳米酶形貌、尺寸均一，分散性好，合成方法工艺简单，可重复性高，经济节约，生物相容性好，有较高的靶向性和较长的体内循环时间以及类过氧化物酶活性，在生物医用领域具有广泛的应用前景。

附图说明：

图1制备得到的双层中空硅酸锰纳米颗粒的TEM图。

图2制备得到的巨噬细胞膜包覆的双层中空硅酸锰纳米颗粒的TEM图。

图3制备得到的巨噬细胞膜包覆的双层中空硅酸锰纳米颗粒不同浓度下类过氧化物酶活性。

具体实施方式