[发明专利]一种联合表达载体及其在玉米籽粒表达虾青素中的应用

说明书

本发明公开了一种联合表达载体及其在玉米籽粒表达虾青素中的应用。所述表达载体包括pBDEN‑CP‑BZ、pBDEN‑CP‑BZ‑LcyEi和pBDEN‑CP‑CH‑LcyEi。本发明将载体中携带的功能基因及启动子转入玉米，选育的玉米籽粒中虾青素高达100μg/g玉米籽粒干重，是原报道的7倍左右，且虾青素均是以高生物活性的反式虾青素为主，这种富含高品质反式虾青素的玉米新种质将为填补我国虾青素需求缺口开辟新的途径。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种虾青素表达载体及其应用，并确定虾青素玉米最佳储存条件和生物利用的方法。

背景技术

虾青素是一种类胡萝卜素，存在于各种藻类、微生物和水生动物中，在高等植物中鲜有报道 (Cunningham and Gantt, 2011)。由于其出色的抗氧化能力和其他生物活性，虾青素作为一种营养补充剂广泛的应用于食品、饲料、保健品、药品和化妆品等产品中。虾青素在饲料工业中,可用作鲍鱼、鲟鱼、鲑鱼、虹鳟鱼、真鲷、甲壳类动物及观赏鱼类、各种禽类和生猪的饲料添加剂。根据体内和体外试验结果表明，虾青素对癌症、高血压、糖尿病、心血管、胃肠道、肝脏、神经退行性疾病和皮肤病等有潜在的积极影响 (Ambati et al.,2014)。欧盟早已批准将虾青素作为人类膳食补充剂，并且美国食品和药物管理局已批准将虾青素用作动物和鱼类饲料中的食物着色剂，我国也在食品和饲料添加剂中大量使用虾青素。然而，在目前的虾青素供应中，化学合成的工艺复杂技术难度大、生物活性低且有安全风险；酵母发酵来源的产量和生物活性低且成品中含糖量过高；雨生红球藻提取也存在技术门槛高、产量不高以及总体成本过高的问题。因此，建立一种高产低成本、生物活性高易操作的虾青素生产体系具有重要意义。

关于虾青素的基因工程研究率先在藻类和微生物中进行。在烟草、拟南芥等模式中均有成功进行的案例。玉米中也有一例关于虾青素基因工程的研究工作，该研究通过基因枪共转化的方式获得同时表达Crbkt和BrcrtZ （Brevundimonas sp., strain SD212）的转基因玉米籽粒积累16.8 μg/g干重的虾青素 (Farré et al., 2016)，但其存在转化方式带来的外源基因碎片化和基因分离的问题以及缺少对种质中的虾青素特性的评价，而我国在玉米中没有类似的研究服务于我国的虾青素市场需求。目前，华南农业大学刘耀光院士团队在水稻胚乳中成功重构了虾青素的代谢途径(Zhu et al., 2018)，其虾青素含量也只有16.0 μg/g水稻干重，远不能满足生产的需要。虾青素的微生物生产方法虽然能产出高虾青素含量，但是，生物活性确很低，如Gerhard Sandmann等通过传统突变和代谢工程结合的办法，产生了一株虾青素干重达到9mg/g的菌株，是已知的产量最高的红发夫酵母。然而，由于红发夫酵母产生的虾青素为（3R ,3′R）构型，抗氧化能力较低，限制了其在商业规模上的使用。专利201010150422.9 公开了一种虾青素生产菌株及其诱变筛选方法与应用，涉及一种微生物菌株及其获取方法。所述虾青素生产菌株为红法夫酵母的诱变菌株N1806-04。以红法夫酵母为出发菌株，采用酶法制备红法夫酵母原生质体，再通过NTG诱变及β-紫罗酮筛选等方法进行虾青素生产菌株的选育，获得虾青素生产菌株，连续传代5次后虾青素的产量稳定。将该虾青素生产菌株用发酵罐放大培养，其虾青素产量和含量分别可达500～600mg/L和5000～6300mg/kg，生物量可达80～110g/L。虽然上述微生物生产的虾青素含量远高于转基因植物种子中的含量，但是，其含有的活性反式虾青素含量低，且该虾青素只是细胞中的含量，还要提取出来才能应用于工业生产，提取的过程中虾青素活性又大量丧失，产率也不见得高于转基因植物的种子，而转基因玉米种子无需提取可以直接用于需要虾青素的饲料，比如高端水产养殖业的三文鱼配合饲料，虹鳟鱼饲料等，也可用于火烈鸟，家禽和宠物饲料等。另外，转基因玉米来源的虾青素没任何异味，藻类来源的有海腥味，酵母来源的有菌味。

发明内容

本发明的目的是提供一种联合表达载体，用于在玉米作物中表达，促进其高效表达虾青素。