[发明专利]一种核酸文库构建方法及其在植入前胚胎染色体结构异常分析中的应用

说明书

本发明涉及核酸文库构建方法及其在植入前胚胎染色体结构异常分析中的应用，通过第一核酸内切酶和第二核酸内切酶组合进行酶切打断，捕获固定片段范围的DNA序列，然后对捕获的特定序列进行测序，在基因组平均测序深度3×以上时，即可在全基因组范围内进行SNP分析，通过家系样本连锁分析进行胚胎平衡易位等检测。该方法降低了全基因组测序所需要的数据量，同时保证了有效SNP位点及其深度，增加了可用单体型构建的SNP位点数量，以很低的测序数据量，获得足量覆盖全基因组的能用来分析单体型的SNP和indels，也无需针对SNP设计多重PCR引物，大大降低所需数据量和检测成本。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种核酸文库构建方法及其在植入前胚胎染色体结构异常分析中的应用。

背景技术

简化基因组测序是通过限制性内切酶切开基因组DNA，对指定部分采用高通量测序，并得到大量遗传多态性标签序列，以将物种全基因组的测序对策充分展现出来的方法。该方法可减少基因组的复杂度，实施过程简便，节约成本，同时不依靠参考基因组也能得到全基因组中的遗传多态性标签，因此广泛应用于分子标记开发、遗传图谱构建、基因/QTL定位和全基因组关联分析及群体遗传分析与分子育种领域。但现有简化基因组测序可捕获的SNP数目少（一般少于20万个），并且其建库流程相对复杂，或者需要经历末端修复、dA尾添加等繁琐建库流程，或者需要使用Pippin或胶回收等进行片段分选。另外其文库构建方法兼容性低，只能对某一测序平台展开，无法灵活兼容多种高通量测序平台。综合上述原因，导致简化基因组测序鲜少在辅助生殖领域得以应用和推广。

胚胎植入前遗传学检测（Preimplantation Genetic Testing，PGT）是指在体外受精的胚胎移植前，取胚胎的遗传物质进行分析，诊断是否有异常，筛选健康胚胎移植，防止遗传病传递的方法。目前，PGT过程中常用的技术手段有荧光原位杂交（FISH）、SNP全基因组微阵列芯片（SNP-array）和高通量测序（NGS）等。基于高通量测序技术的检测方法是在体外受精后的胚胎发育至3~5天时，取8细胞期的卵裂球细胞或者囊胚期的滋养层细胞，进行单细胞全基因组扩增得到基因组DNA，然后构建测序文库进行测序，根据测序结果进行后续分析。

但是，为了获得胚胎遗传病携带情况，在构建文库时通常需要针对遗传病基因上下游紧密连锁的SNP位点设计多重引物对进行扩增，且需要获得很高的数据量以保证有效SNP位点及其测序深度，检测耗时且成本较高。并且每次针对不同遗传病，需要重新单独设计多重SNP位点扩增引物，然后需要对多重引物对进行验证测试和优化，并在真正检测胚胎前，还需要先进行家系（含夫妻双方和先证者）预实验，在预实验结果能够获得足量有效SNP位点的情况下，才可以展开胚胎样本的检测。这种传统方法整个检测周期过长，失败风险高，不利于临床应用推广，同时因仅针对遗传病基因上下游的少量SNP位点捕获测序，极易因同源重组而导致分析错误。

发明内容

基于此，有必要提供一种可降低全基因组测序所需要的数据量且无需针对SNP设计多重引物的核酸文库构建方法。

一种核酸文库构建方法，包括以下步骤：

获取目标人源样本的基因组DNA；

采用第一核酸内切酶和第二核酸内切酶组合对所述基因组DNA进行切割得到高密度酶切产物；所述第一核酸内切酶和第二核酸内切酶组合可以在人基因组上平均每1Mb区段内产生2000~5000个酶切位点，并在其酶切片段两端产生2~5nt的粘性末端；

将所述酶切产物与测序接头连接，得到连接产物；所述测序接头包括第一接头和第二接头，所述第一接头能够与所述第一核酸内切酶切割产生的粘性末端互补，所述第二接头能够与所述第二核酸内切酶切割产生的粘性末端互补；

从所述连接产物中筛选获得200bp~400bp的片段；

最后使用高通量测序平台通用引物进行PCR扩增，得到测序文库。