[发明专利]基于SARS-CoV-2 S蛋白RBD区域的靶向性外泌体及其制备方法

说明书

本发明公开了一种基于SARS‑CoV‑2 S蛋白RBD区域的靶向性外泌体及其制备方法，属于生物医药技术领域。本发明的靶向性外泌体上表达RBD‑VSVG融合蛋白，所述的RBD‑VSVG融合蛋白为SARS‑CoV‑2 S蛋白的RBD替换VSVG的胞外区域得到。本发明构建了能够高效、组织特异性的递送抗SARS‑CoV‑2潜在药物的靶向外泌体；利用靶向外泌体包裹SARS‑CoV‑2 siRNA，从而实现在组织器官中特异性抑制病毒复制。在小鼠动物模型中，尾静脉注射外泌体包裹SARS‑CoV‑2 siRNA，能够显著抑制小鼠肺组织中的病毒复制量，减轻病毒感染引发的肺炎等症状。

技术领域

本发明涉及一种基于SARS-CoV-2 S蛋白RBD区域的靶向性外泌体及其制备方法，属于生物医药技术领域。

背景技术

严重急性呼吸系统综合征II型冠状病毒(SARS-CoV-2)是2019冠状病毒病(COVID-19)的病因，死亡率一直处于上升态势，成为全球重大公共健康问题。到目前为止，还没有特异性的药物或疫苗得到正式批准。结构分析和病理观察确认SARS-CoV-2病毒进入组织器官是通过与宿主细胞上的血管紧张素转换酶2(ACE-2)结合，病毒进入细胞取决于特异性识别ACE2的SARS-CoV-2刺突蛋白(S)的受体结合域(RBD)。目前认为阻断RBD和ACE2结合是开发疫苗、中和抗体和小分子药物对抗COVID-19的主要潜在策略。

外泌体是由多种细胞类型分泌的天然运输纳米囊泡(约30-100nm)。目前已知外泌体能够将特定的功能性生物分子(如核酸，包括质粒DNA和小干扰RNA、抗体及小分子药物)输送到受体细胞或组织器官，发挥治疗特定疾病的能力。然而，已有研究表明，大多数静脉注射的外泌体被肝脏所吸收代谢，因此，需要通过对外泌体改造，使其具备靶向治疗能力，将外源性治疗药物递送到体内特定的组织或细胞。目前为止，并没有特异性运输治疗COVID-19药物的靶向载体，本项发明通过对外泌体的改造，使其具备靶向SARS-CoV-2嗜性的组织器官，为运输相关特异性抗病毒药物提供靶向载体，实现对SARS-CoV-2感染的精准治疗。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种基于SARS-CoV-2 S蛋白RBD区域的靶向性外泌体，能够高效、组织特异性的递送抗SARS-CoV-2潜在药物。

本发明的第一个目的是提供一种基于SARS-CoV-2 S蛋白RBD区域的靶向性外泌体，所述靶向性外泌体上表达RBD-VSVG融合蛋白，所述的RBD-VSVG融合蛋白为SARS-CoV-2(严重急性呼吸系统综合征II型冠状病毒)S蛋白(刺突蛋白)的RBD(受体结合域)替换VSVG(水泡性口炎病毒糖蛋白G)的胞外区域得到。

进一步地，所述的RBD-VSVG融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述的RBD-VSVG融合蛋白的氮端设有信号肽。

进一步地，所述的信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二个目的是提供所述的靶向性外泌体的制备方法，包括如下步骤：

S1、以含有SARS-CoV-2的样本cDNA为模板，PCR扩增获得RBD片段；

S2、体外合成VSVG的跨膜区及胞内区全长基因片段；

S3、将S1步骤的RBD片段和S2步骤的VSVG的跨膜区及胞内区全长基因片段进行连接，并连接到载体上得到表达载体；

S4、将S3步骤的表达载体转入宿主细胞中，培养后收集细胞培养上清，分离得到所述的靶向性外泌体。

进一步地，所述的宿主细胞为293T细胞或树突状细胞。

进一步地，所述的载体是pCMV载体。