[发明专利]大黄鱼抗肿瘤肽piscidin 5 like及其制备方法与应用

说明书

大黄鱼抗肿瘤肽piscidin 5 like及其制备方法与应用，涉及大黄鱼抗菌肽。在分离得到Lc‑p5L的基础上，根据Lc‑p5L基因序列特征成功构建重组表达载体并在大肠杆菌系统中表达并纯化获得重组rLc‑p5L蛋白，构建了Lc‑P5L的pET‑28a重组表达载体，并转化至宿主细胞E.coli BL21(DE3)中，在宿主细胞中进行诱导表达，得到表达产物，并对表达产物进行分离纯化，从而得到重组蛋白rLc‑P5L。具有表达产量较高，生物活性强，表达系统简单，生产成本低，无毒害物质等优点，适用于大规模发酵生产，可为人工修饰成为更具高抗肿瘤活性的物质提供理论数据和支撑。

技术领域

本发明涉及大黄鱼抗菌肽，尤其是涉及大黄鱼抗肿瘤肽piscidin 5 like及其制备方法与应用。

背景技术

随着对抗菌肽(antimicrobial peptides)研究的发展，学者发现抗菌肽是一类最有希望能完全或部分替代抗生素的候选物。抗菌肽靶向细胞膜的独特作用方式几乎不会引起抗性的产生。因此，在过去的若干年里，大量的工作和努力致力于对抗菌肽的研究^[1-3]，并且越来越多的抗菌肽被从细菌、动物、植物中分离出来。其中生物多样性较高的海洋生物是丰富的抗菌肽的重要来源。

研究发现一些抗菌肽具有很强的抗肿瘤活性^[4]，且具有很大的潜力发展成为一种药物。我们都知道，癌细胞细胞膜上的能量依赖型转运蛋白，如P-葡糖蛋白，使一些已经存在的抗癌药物(如阿霉素或vinca alkaloids)变得无效，因为获得抗性的P-葡糖蛋白能够降低细胞内药物浓度^[5]。尤其耐药性的产生逐渐在世界范围内都引发了对肿瘤或炎症治疗失败的担忧。以前的研究发现肿瘤细胞或细菌的细胞膜携带有更多的净负电荷，如磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)^[6]、O-糖基化粘蛋白(O-glycosylated mucins)^[7]、脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)、脂磷壁酸(lipoteichoic acid，LTA)。大部分的抗菌肽、或称之为抗肿瘤肽(anticancer peptides，ACPs)拥有两亲性结构、有限结合并插入到带负电的细胞膜以破坏细胞或线粒体膜^[8-9]，因此，不难理解为什么阳性肽更容易靶向并破坏肿瘤细胞、病原菌细胞膜。类似于抗菌机制，ACPs的抗肿瘤作用机制也是多样的。比如CS5931能够激活HCT-8细胞的caspase 9and 3表现出显著的抗增殖、促凋亡活性^[10]；Pleurocidin家族的NRC-03、NRC-07成员能够裂解乳腺癌细胞的细胞膜^[11]；Kahalalide F通过消耗乳腺癌细胞系SKBR3的ErbB3(human epidermal growth factor receptor 3)和抑制Akt(proteinkinase B)信号引起细胞的坏死样死亡^[12]；Magainin 2或tachyplesin能够通过线粒体通路激活caspase-9/3诱导凋亡^[13-14]；A₉K可穿透进入HeLa细胞影响F-actin的重建，进而引起线粒体的功能紊乱^[15]。

Piscidins拥有多样的抗性活性，包括抗菌、抗寄生虫、抗病毒、抗肿瘤活性。大黄鱼piscidin-like(Lc-pis)能够结合到HeLa细胞上并引起其死亡，Lc-pis主要聚集在核膜的周围，人工修饰Lc-pis的正电荷增强了该效应，然而，负电荷消除了聚集效应，因此Lc-pis具有抗肿瘤活性^[16]。体外重组表达大黄鱼piscidin 5 like的抗肿瘤活性的检测对于丰富海洋生物源抗肿瘤候选肽提供基础参考依据。

参考文献：