[发明专利]一种含单跨膜区的膜蛋白其跨膜区的纯化方法

权利要求书

1.一种含单跨膜区的膜蛋白其跨膜区的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：在含单跨膜区的膜蛋白的N或C端加入多聚组氨酸标签，然后将此含组氨酸标签的含单跨膜区的膜蛋白的编码基因转入到表达质粒中，再将表达质粒转入表达菌中，培养表达菌并诱导含单跨膜区的膜蛋白的表达，将表达菌破碎，并用含尿素和变性剂的缓冲液将含单跨膜区的膜蛋白溶解，在有尿素的情况下利用组氨酸标签对单跨膜区的膜蛋白进行纯化，并同时用再折叠剂使单跨膜区的膜蛋白再折叠并去除尿素，获得折叠的单跨膜区的膜蛋白。

2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，去除尿素后的折叠的单跨膜区的膜蛋白再利用分子筛层析法将蛋白进一步纯化并去除蛋白缓冲液中的咪唑。

3.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，是将去除尿素后的折叠的单跨膜区的膜蛋白上样分子筛层析柱，然后用洗脱缓冲液洗脱，所述的洗脱缓冲液是20mM磷酸钠、100mM氯化钠、质量分数0.2％十二烷基磺酸钠，pH 6.5。

4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述的表达菌是大肠杆菌。

5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述的含尿素和变性剂的缓冲液，其尿素浓度为6M，变性剂为十二烷基磺酸钠，浓度为质量分数2％，所述的在有尿素的情况下利用组氨酸标签对单跨膜区的膜蛋白进行纯化，其尿素浓度为6M。

6.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，在含单跨膜区的膜蛋白的N或C端加入多聚组氨酸标签，然后将此含组氨酸标签的含单跨膜区的膜蛋白的编码基因转入到表达质粒中，再将表达质粒转入大肠杆菌中，培养大肠杆菌并诱导含单跨膜区的膜蛋白的表达，收集大肠杆菌，悬浮于缓冲液1中，冰浴下用超声波破碎，然后加入尿素至6M，直至蛋白溶解，细胞破碎液离心，收集上清液，所述的缓冲液1为：20mM磷酸钠，500mM氯化钠和质量分数2％十二烷基磺酸钠，pH 7.8；

取平衡后的Ni-NTA纯化介质与上清液混合吸附，装柱，待液体流出后，用缓冲液2清洗纯化介质，然后再用折叠缓冲液3冲洗，去除尿素并使蛋白折叠，最后利用洗脱液洗脱将含单跨膜区的膜蛋白与纯化介质分离；

所述的缓冲液2为20mM磷酸钠,100mM氯化钠，6M尿素，质量分数0.2％十二烷基磺酸钠和10mM咪唑，pH 7.8；

所述的折叠缓冲液3为20mM磷酸钠,100mM氯化钠和质量分数0.2％十二烷基磺酸钠，pH6.5；

所述的洗脱缓冲液为20mM磷酸钠,100mM氯化钠和质量分数0.2％十二烷基磺酸钠，pH6.5。

7.根据权利要求6所述的纯化方法，其特征在于，所述的再用折叠缓冲液3冲洗，去除尿素并使蛋白折叠为用折叠缓冲液3冲洗，去除尿素，然后转换变性剂，用折叠缓冲液4冲洗，所述的折叠缓冲液4为20mM磷酸钠,100mM氯化钠和质量分数0.2％十二烷基磷酰胆碱，pH6.5。