[发明专利]一种牙髓干细胞大规模常温消化方法

说明书

一种牙髓干细胞大规模常温消化方法,通过比较几种消化方式对细胞的影响，优化消化方式，在常温条件下实现大规模消化生产，整个消化操作在生物安全柜中进行，减少细胞污染的风险，操作更加连贯；节省了耗材和培养基用量，降低成本；且无需占用培养箱和显微镜；无需离心，提高了细胞的增殖活力；提升了单次处理瓶数；缩短了细胞消化操作时间；提高了牙髓干细胞消化工艺的生产效率。

技术领域

本发明涉及牙髓干细胞技术领域，具体涉及一种牙髓干细胞大规模常温消化方法。

背景技术

牙髓干细胞是一种存在于人牙髓组织中具有高度增殖能力和多向分化潜能的间充质干细胞，来源丰富、取材安全方便、不涉及伦理学问题、免疫原性低，较其他间充质干细胞更具有优势，已成功用于牙齿、骨、神经、肌肉、角膜等组织重建及再生等临床应用研究，在组织工程修复和再生医学中有广泛的应用前景。尤其在牙周组织再生方面，“人牙髓间充质干细胞注射液”已获国家药品监督管理局药品审评中心（CDE）临床默示许可，有望为人类慢性牙周炎的再生治疗提供新的治疗药物和方法。

牙髓干细胞作为再生医学重要的细胞来源之一，体外培养获得大量质量稳定的干细胞是牙髓干细胞进入临床应用的前提条件。然而牙髓组织量少，需在体外进行大量扩增得到足量的细胞。牙髓干细胞呈贴壁生长，每扩增一代需进行一次消化。消化是利用消化酶通过在特定位置上降解蛋白，使细胞间结合处蛋白降解，这时细胞在自身内部细胞骨架的张力作用下成为球形，从而使细胞间分离。因而细胞消化是影响细胞生长状态好坏的关键因素之一。

目前牙髓干细胞常规的消化方法，是在生物安全柜中加入胰酶后，放入37℃培养箱进行消化，然后在倒置相差显微镜下观察细胞消化情况，再转移至生物安全柜中吹打，收集细胞悬液离心去除胰酶，加培养基用于后续培养。在消化过程中，细胞来回进出生物安全柜，人员频繁走动，增加细胞污染的风险，而且消化过程占用培养箱和显微镜，因37℃胰酶作用时间短使得单次处理瓶数有限，消化后需离心去除胰酶，造成一定的细胞损耗和离心对细胞的损伤。

发明内容

针对现有技术存在的缺陷，本发明提供一种牙髓干细胞大规模常温消化方法，减少细胞污染的风险，操作更加连贯；节省了耗材和培养基用量，降低成本；且无需占用培养箱和显微镜；无需离心，提高了细胞的增殖活力；提升了单次处理瓶数；缩短了细胞消化操作时间；提高了牙髓干细胞消化工艺的生产效率。

本发明采用的技术解决方案是：一种牙髓干细胞大规模常温消化方法，包括以下步骤：

（1）从培养箱中取出具有牙髓干细胞的培养瓶喷酒精后放至生物安全柜；

（2）倒液弃培养基上清液；

（3）加入DPBS清洗培养瓶并倒液弃除；

（4）加入重组胰酶，温和摇动培养瓶使重组胰酶浸润细胞后立即弃除重组胰酶；

（5）放倒培养瓶在生物安全柜台面上，常温消化至大部分细胞开始皱缩、细胞边界明显时，轻轻拍打培养瓶细胞面；

（6）倒入培养基终止消化；

（7）水平方向前后摇晃培养瓶使细胞从培养瓶上脱落，倒液转移至储液瓶，用移液管吹打细胞悬液至单细胞，即完成消化。

所述的培养瓶内的牙髓干细胞为传代的牙髓干细胞。

所述的步骤（4）中弃除重组胰酶采用浸润后倒液弃除的方式。

所述的步骤（3）中加入DPBS的量为2-10ml。

所述步骤（4）中加入的重组胰酶的量为1-5ml。

所述步骤（5）中常温消化至大部分细胞开始皱缩、细胞边界明显的时间为60-180s。

所述步骤（6）中加入的培养基为5-10ml。