[发明专利]检测靶点数多于荧光通道数的实时PCR技术及其应用

说明书

本发明公开了检测靶点数多于荧光通道数的实时PCR技术，在PCR仪的多个荧光通道中存在：1)至少有一个荧光通道检测两种以上的待测靶点；2)至少有一个靶点被两个以上的荧光通道所检测；3)至少有一个荧光通道检测26％以上的待测靶点；以及4)至少有一个荧光通道所检测的靶点数与其他荧光通道所检测的靶点数不相同。本发明通过采用单一荧光通道检测不同基因序列片段和不同通道检测不同基因片段的不同比例关系，在需要使用内参时，避免了必须内参使用非靶点序列和内参需要单独占用一个荧光通道的缺点，并可增加不同比例不同序列内参以提高检测特异性和防污染能力。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种核酸分析技术，特别涉及检测靶点数多于荧光通道数的实时PCR技术及其应用。

背景技术

聚合酶链式反应PCR已广泛应用于基础研究和临床实践。多种PCR技术，尤其是实时荧光PCR技术，在临床上基因定性与定量分析中更是扩展了基因检测的范围。目前临床常用的荧光PCR仪，主要为提供4种或5种荧光通道，一般检测可以利用一个荧光通道作为内参，其余3种或4种荧光通道用于检测待测标本；或者，可以利用外在标准曲线的定性和定量方法。现有的核酸检测分析技术存在如下缺陷：

1)检测靶点数量有限，在4通道仪器中，现有技术中最高检测3～4个靶点；

2)检测敏感性不高；

3)出现假阳性检测结果；

4)不耐突变。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明在于提供检测靶点数多于荧光通道数的实时PCR技术及其应用，其能够提高实时PCR用于定性鉴定特定基因序列的敏感性和特异性的目的。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：检测靶点数多于荧光通道数的实时PCR技术，在PCR仪的多个荧光通道中存在：

1)至少有一个荧光通道检测两种以上的待测靶点；

2)至少有一个待测靶点被两个以上的荧光通道所检测；

3)至少有一个荧光通道检测26％以上的待测靶点；以及

4)至少有一个荧光通道所检测的靶点数与其他荧光通道所检测的靶点数不相同。

作为优选，所述检测26％以上的待测靶点的荧光通道采用特异荧光标记的荧光探针。

作为优选，所述检测26％以上的待测靶点的荧光通道采用非特异荧光染料。

作为优选，所述非特异荧光染料是Sybr Green。

作为优选，在检测RNA标本时，采用实时荧光rt-PCR。

作为优选，在检测DNA标本时，采用实时荧光PCR。

作为优选，存在两种以上的待测靶点的荧光通道中加入至少两个与所述待测靶点相对应的探针。

作为优选，在存在两种以上的待测靶点的荧光通道中，该荧光通道中有N个待测靶点以及与所述待测靶点相对应的N个探针，其中，探针混合液中的每个探针的浓度为探针工作液的1/N。

作为优选，所述荧光探针为TaqMan探针或者分子信标探针。

如上述所述的检测靶点数多于荧光通道数的实时PCR技术在核酸定性与定量分析中的应用。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

1、本发明通过采用单一荧光通道检测不同基因序列片段和不同通道检测不同基因片段的不同比例关系，在需要使用内参时，避免了必须内参仅仅使用非靶点序列和内参需要单独占用一个荧光通道的缺点，并增加不同比例不同序列内参以提高检测特异性和防污染能力；