[发明专利]生产马来酸的工程菌及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种生产马来酸的工程菌，其特征在于：包括在宿主内共表达编码异分支酸合成酶（EntC）、异分支酸丙酮酸裂解酶（PchB）、水杨酸-5-羟化酶、马来酰丙酮酸异构酶和马来酰丙酮酸裂解酶的基因；所述水杨酸-5-羟化酶为NagAaGHAb，

并且所述宿主内同时敲除了编码pheA、tyrA、pykA和pykF的基因，在基因组内源整合了编码EntC和PchB的基因并用T7启动子控制表达；

并且所述宿主内过表达编码莽草酸激酶、DAHP合成酶、PEP合成酶和转酮酶A的基因；所述宿主为大肠杆菌菌株BW25113（F’）。

2.构建如权利要求1所述的生产马来酸的工程菌的方法，其特征在于，包括步骤：

（1）构建重组表达质粒

将编码异分支酸合成酶、异分支酸丙酮酸裂解酶、水杨酸-5-羟化酶NagAaGHAb、马来酰丙酮酸异构酶和马来酰丙酮酸水解酶的基因连接至表达质粒上，获得重组质粒载体；

（2）构建工程菌

将所述重组质粒载体转化到宿主中，并且采用Red重组的方法敲除宿主中的pheA、tyrA、pykA和pykF基因，采用中拷贝质粒共表达编码莽草酸激酶、DAHP合成酶、PEP合成酶、转酮酶A的基因，得到生产马来酸的工程菌；所述宿主为大肠杆菌菌株BW25113（F’）。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：采用高拷贝质粒表达水杨酸-5-羟化酶NagAaGHAb的基因，利用中拷贝质粒表达马来酰丙酮酸异构酶和马来酰丙酮酸水解酶的基因。

4.一种权利要求1所述的生产马来酸的工程菌的应用，其特征在于：按照体积比1％～2％的接种量，将权利要求1所述的生产马来酸的工程菌接种到培养基中，并在菌株OD达到0.6时加入0.5mM诱导剂，在30℃进行发酵处理，制得马来酸；所述培养基中的碳源为葡萄糖或葡萄糖和甘油的组合。

5.根据权利要求4的应用，其特征在于：所述培养基包括2g·L^-1MOPS(3-吗啉丙磺酸)，5g·L L^-1葡萄糖，30g·L^-1甘油，7g·L^-1酵母粉，3g·L^-1蛋白胨，17.1g·L^-1Na₂HPO₄·12H₂0，0.5g·L^-1NaCl，3g·L^-1KH₂PO₄，1g·L^-1NH₄Cl，245mg·L^-1MgSO₄，15mg·L^-1CaCl₂，其余部分用去离子水补充。