[发明专利]阻断铁皮石斛组培苗被细菌污染的方法

说明书

本发明提供一种阻断铁皮石斛组培苗被细菌污染的方法，其特征在于包括以下步骤：1）纳米铜母液制备，2）纳米铜母液稀释，3）消毒液配制，4）混合培养基Ⅰ制备，5）铁皮石斛种子消毒，6）铁皮石斛种子培养，7）铁皮石斛种子分化培养，8）混合培养基Ⅱ制备，9）分化幼胚培养，10）瓶苗培养、移栽。将10^‑2%的纳米铜溶液加入到培养基中，在种子萌发及幼胚分化两个培养过程中，对侵染细菌进行阻断，有效降低了铁皮石斛的细菌污染率，具有独特的技术效果，阻断率高达93%。能够减少抗生素对植物的伤害，提高铁皮石斛种苗的成活率，即使存在污染，亦能阻断，从而保存下大量的实验材料。

技术领域

本发明涉及新材料及植物组织培养领域，特别是涉及到利用纳米铜阻断铁皮石斛组培苗细菌污染的方法。

背景技术

利用先进的物理、化学、生物等技术制成的，具有一维、二维或三维且尺度只有几纳米或几十纳米的纳米材料，其结构与普通材料有很大的不同，如纳米晶界的原子间距大、密度低、原子排列具有随机性等。近年来，有关利用纳米铜来抗菌的相关研究也逐渐引起关注。纳米铜因其量子效应、小尺寸效应、表面积大等特点，展现较好的安全性、抗菌性及抗菌长效性。

铁皮石斛果荚开裂后暴露的种子经过无菌处理后，仍然容易造成细菌污染。

因此，有必要研究新的能阻断铁皮石斛组培苗细菌污染的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能够有效阻断铁皮石斛组培苗被细菌污染的方法。

本发明通过下列技术方案完成：一种阻断铁皮石斛组培苗被细菌污染的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）纳米铜母液制备，将纳米铜放入灭菌蒸馏水中，在40-60℃温度下冰浴20-40分钟，之后在该冰浴条件下，放入超声波细胞破碎仪中处理20-40分钟，得到质量浓度为0.1%的纳米铜母液；

2）纳米铜母液稀释，在步骤1）的纳米铜母液中加入灭菌蒸馏水，稀释成质量浓度为10^-2 %的纳米铜溶液，送入烘箱中，升温至60-70℃后保温，维持纳米铜的活性；

3）消毒液配制，将优洁1003消毒液加入到无菌蒸馏水中，至质量浓度为0.2%，于110-125℃、0.1Mpa条件下，高压灭菌20-30min，得消毒液；

4）混合培养基Ⅰ制备，将下列培养基MS+NAA 0.05ml/l + 6-BA 0.1ml/l + 香蕉泥50g/l + 马铃薯50g/l + 白糖30g/l + 琼脂7g/l，于110-125℃、0.1Mpa条件下，高压灭菌20-30min后，冷却至50-60℃，并在无菌条件下，按照1L培养基加入20ml质量浓度为10^-2 %的纳米铜溶液的量，将质量浓度为10^-2%的纳米铜溶液加入到培养基中，并搅拌混合均匀，得混合培养基Ⅰ；

5）铁皮石斛种子消毒，将铁皮石斛破出果荚、取出种子，放入经高压灭菌处理过的纱布袋中，置入质量浓度为70%的酒精中浸泡40-60秒；然后依次用无菌水洗涤2-4次、质量浓度为0.1%的升汞灭菌6-10min、无菌水洗涤2-4次，再用质量浓度为10%的次氯酸钠浸泡6-10min，无菌水洗涤2-4次；再用步骤3）的消毒液浸泡1-2min，取出，于无菌操作台上，用无菌吸水纸吸干，得消毒种子；

6）铁皮石斛种子培养，将步骤5）的消毒种子均匀放在步骤4）的混合培养基Ⅰ中，暗培养至种子萌发后，转入1000lux弱光下，培养25-30天，得幼胚；

7）铁皮石斛种子分化培养，将步骤6）幼胚移至22-26℃、1000lux的无菌环境中，培养6-8天，移至光照条件下继续培养至铁皮石斛幼胚分化；