[发明专利]一种人体血管周围脂肪组织单细胞悬液制备方法

说明书

本发明公开了一种人体血管周围脂肪组织单细胞悬液制备方法，包括：脂肪组织预处理：将采集的脂肪组织清洗至无血液残留，再将脂肪组织切成1‑5mm的脂肪微粒；预消化：脂肪微粒中滴加胶原酶至覆盖住脂肪组织，再剪碎脂肪组织，直至变为酱状；消化：将预消化后的脂肪组织再加入胶原酶，37℃水浴消化20分钟，期间反复改变摇动方向，离心摇动；过滤：将上步获得的消化液过40μm孔径的细胞滤筛，加入相同体积的DPBS后置于冰上；取筛网上未通过的组织块，重复消化和过滤步骤；将最终获取的消化液离心，离心后分层，吸取上清，将底部细胞重悬，再离心，获得人体血管周围脂肪组织单细胞悬液。该方法得到的人体血管周围脂肪组织单细胞悬液的数量多、细胞活率高。

技术领域

本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种人体血管周围脂肪组织单细胞悬液制备方法。

背景技术

血管周围脂肪组织(Perivascular adipose tissue,PVAT)是指围绕在不同血管床(脑血管、毛细血管、肺血管除外)周围的脂肪组织，近年来逐渐在心血管病理生理学领域发挥越来越重要的作用。PVAT微环境由多种细胞类型和细胞因子组成。PVAT旁分泌/内分泌的细胞因子可以归类血管周围因子(血管周围收缩、舒张因子)、脂肪因子(如脂联素和瘦素等)、炎性细胞因子(如肿瘤坏死因子-α和白介素等)以及某些气态分子，如一氧化氮(NO)和硫化氢(H₂S)。PVAT由多种类型的细胞组成，主要包括血管周围的脂肪细胞，成纤维细胞，巨噬细胞，T淋巴细胞及B淋巴细胞。此外，PVAT中的常驻多能干细胞，亦称为间充质干细胞，具有向脂肪细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和成骨细胞分化的多种分化能力。

以往对PVAT细胞构成和相关基因、蛋白的研究主要采用流式细胞术、组织转录组测序、全基因组测序、微阵列等方式进行。然而这些方法只能探索组织基因或已知蛋白的表达情况，不能排除脂肪组织异质性的局限性。单细胞测序技术的发明，为细胞异质性分析、细胞类型鉴定、信号通路差异响应、分子调控网络等领域带来了全新的研究方法与便利的实验手段。

单细胞测序的实验关键在于单细胞悬液制备的质量(细胞活率要求高于80％)。脂肪组织相关单细胞测序研究较少的科学难题在于人体脂肪组织的消解难度较高，细胞活率较低(通常低于70％)。为推动血管周围脂肪组织的精准医学研究，亟需开发符合单细胞测序上机要求的血管周围脂肪组织单细胞悬液制备的方法。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种满足单细胞测序技术所需的人体血管周围脂肪组织单细胞悬液制备方法，该方法获得的脂肪组织单细胞悬液的细胞平均活率可达91％。该培养方法采用从病人颈动脉周围获取的颈动脉血管周围脂肪组织，经组织消解、清洗等程序，获得满足单细胞测序上机要求的单细胞悬液。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本申请的一种人体血管周围脂肪组织单细胞悬液的制备方法，包括如下步骤：

(A)脂肪组织预处理：将采集的脂肪组织清洗至无血液残留，再将清洗后的脂肪组织切成1-5mm的脂肪微粒；

(B)预消化：脂肪微粒中滴加0.05％II型胶原酶至覆盖住脂肪组织，再剪碎脂肪组织，直至脂肪组织变为酱状；

(C)消化：将预消化后的脂肪组织再加入0.05％II型胶原酶，37℃水浴消化20分钟，期间反复改变摇动方向，离心摇动；

(D)过滤：将步骤(C)中获得的消化液过40μm孔径的细胞滤筛，加入相同体积的DPBS后置于冰上；

(E)取筛网上未通过的组织块，重复步骤(C)至(D)；

(F)将步骤(D)和步骤(E)中获取的消化液离心，离心后分层，吸取上清，将底部细胞用DPBS重悬，再离心，若杂质较多，再重复使用DPBS进行清洗，获得人体血管周围脂肪组织单细胞悬液。