[发明专利]III类脱氧核酶突变体及其制备方法与应用在审
申请号: | 202011120065.1 | 申请日: | 2020-10-19 |
公开(公告)号: | CN112301020A | 公开(公告)日: | 2021-02-02 |
发明(设计)人: | 顾宏周;张灿钰;李青婷 | 申请(专利权)人: | 复旦大学附属肿瘤医院 |
主分类号: | C12N9/22 | 分类号: | C12N9/22;C12N15/55;C12N15/10 |
代理公司: | 上海容慧专利代理事务所(普通合伙) 31287 | 代理人: | 于晓菁 |
地址: | 200032 *** | 国省代码: | 上海;31 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | iii 脱氧 突变体 及其 制备 方法 应用 | ||
1.一种III类脱氧核酶突变体,其特征在于,其结构通式为:P1-(N)x-P2-P2′-(N)w-P1′,x、w均为正整数,且(N)w中含有切割位点,所述切割位点为T/G之间;
其中(N)x的序列中至少含有一个C,(N)w序列选自含有如SEQ ID NO.14所示的序列;
P1与P1′上的核苷酸序列全部或部分互补配对而组成亚结构域1;
P2与P2′上的核苷酸序列全部或部分互补配对而组成亚结构域2。
2.根据权利要求1所述的III类脱氧核酶突变体,其特征在于,所述(N)x选自包含有如SEQ ID NO.16所示的序列。
3.根据权利要求2所述的III类脱氧核酶突变体,其特征在于,所述(N)x选自包含有如SEQ ID NO.9所示或如SEQ ID NO.12所示的序列。
4.根据权利要求1-3任一项所述的III类脱氧核酶突变体,其特征在于,所述(N)w选自包含有如SEQ ID NO.17所示的序列。
5.根据权利要求4所述的III类脱氧核酶突变体,其特征在于,所述(N)w选自包含有如SEQ ID NO.10所示或如SEQ ID NO.13所示的序列。
6.根据权利要求1-3、5任一项所述的III类脱氧核酶突变体,其特征在于,所述P2与P2′上的核苷酸序列全部或部分互补配对而组成亚结构域2中,P2与P2′之间含有长度为4-6nt的loop区域。
7.权利要求1-6任一项所述的III类脱氧核酶突变体在切割长单链DNA中的应用。
8.权利要求1-6任一项所述的III类脱氧核酶突变体的体外筛选方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)构建两个DNA单链文库,互为引物进行聚合酶链式反应获得线性单链DNA:所述两个单链DNA文库的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示,SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的末端含有的互补区域;且SEQ ID NO.2末端带有rC修饰;
(2)以所述线性单链DNA为底物进行第一次环化反应;
(3)预筛选、筛选、成环、PCR扩增、二次成环;所述二次成环的引物如SEQ ID NO.3、SEQID NO.4所示。
9.根据权利要求8所述的III类脱氧核酶突变体的体外筛选方法,其特征在于,还包括以下步骤:将权利要求15所述的步骤(3)获得产物的碱基进行部分随机化处理后,重复多次进行以下步骤:第一次环化反应、预筛选、筛选、成环、PCR扩增、二次成环。
10.根据权利要求8或9所述的III类脱氧核酶突变体的体外筛选方法,其特征在于,所述预筛选为:环化后的单链DNA文库通过PAGE分离回收,加入哌啶,加热;通过变性PAGE分离回收、常温洗脱;和/或
所述筛选为将预筛选获得的环状DNA在缓冲液1中变性,室温放置后加入预热好的等体积的缓冲液2,孵育,通过变性PAGE回收发生切割的线性DNA片段;所述缓冲液1的组分包括HEPES和LiCl;所述缓冲液2的组分包括HEPES、LiCl、MgCl2和ZnCl2。
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