[发明专利]III类脱氧核酶突变体及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种III类脱氧核酶突变体，其特征在于，其结构通式为：P1-(N)_x-P2-P2′-(N)_w-P1′，x、w均为正整数，且(N)_w中含有切割位点，所述切割位点为T/G之间；

其中(N)_x的序列中至少含有一个C，(N)_w序列选自含有如SEQ ID NO.14所示的序列；

P1与P1′上的核苷酸序列全部或部分互补配对而组成亚结构域1；

P2与P2′上的核苷酸序列全部或部分互补配对而组成亚结构域2。

2.根据权利要求1所述的III类脱氧核酶突变体，其特征在于，所述(N)_x选自包含有如SEQ ID NO.16所示的序列。

3.根据权利要求2所述的III类脱氧核酶突变体，其特征在于，所述(N)_x选自包含有如SEQ ID NO.9所示或如SEQ ID NO.12所示的序列。

4.根据权利要求1-3任一项所述的III类脱氧核酶突变体，其特征在于，所述(N)_w选自包含有如SEQ ID NO.17所示的序列。

5.根据权利要求4所述的III类脱氧核酶突变体，其特征在于，所述(N)_w选自包含有如SEQ ID NO.10所示或如SEQ ID NO.13所示的序列。

6.根据权利要求1-3、5任一项所述的III类脱氧核酶突变体，其特征在于，所述P2与P2′上的核苷酸序列全部或部分互补配对而组成亚结构域2中，P2与P2′之间含有长度为4-6nt的loop区域。

7.权利要求1-6任一项所述的III类脱氧核酶突变体在切割长单链DNA中的应用。

8.权利要求1-6任一项所述的III类脱氧核酶突变体的体外筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建两个DNA单链文库，互为引物进行聚合酶链式反应获得线性单链DNA：所述两个单链DNA文库的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的末端含有的互补区域；且SEQ ID NO.2末端带有rC修饰；

(2)以所述线性单链DNA为底物进行第一次环化反应；

(3)预筛选、筛选、成环、PCR扩增、二次成环；所述二次成环的引物如SEQ ID NO.3、SEQID NO.4所示。

9.根据权利要求8所述的III类脱氧核酶突变体的体外筛选方法，其特征在于，还包括以下步骤：将权利要求15所述的步骤(3)获得产物的碱基进行部分随机化处理后，重复多次进行以下步骤：第一次环化反应、预筛选、筛选、成环、PCR扩增、二次成环。

10.根据权利要求8或9所述的III类脱氧核酶突变体的体外筛选方法，其特征在于，所述预筛选为：环化后的单链DNA文库通过PAGE分离回收，加入哌啶，加热；通过变性PAGE分离回收、常温洗脱；和/或

所述筛选为将预筛选获得的环状DNA在缓冲液1中变性，室温放置后加入预热好的等体积的缓冲液2，孵育，通过变性PAGE回收发生切割的线性DNA片段；所述缓冲液1的组分包括HEPES和LiCl；所述缓冲液2的组分包括HEPES、LiCl、MgCl₂和ZnCl₂。