[发明专利]同时检测单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒的试剂盒及方法

说明书

本发明公开了同时检测单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒的试剂盒及方法。本发明应用实时荧光定量PCR技术，采用单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒高度特异的引物和探针，通过一个PCR反应即可判定待测样本中是否存在这4种病毒，比单重荧光定量PCR方法更便捷迅速、节约成本。利用本发明试剂盒对4种病毒的检测灵敏度均达到10copies/mL，其特异性很好，不和其他病毒发生交叉反应；同时，本发明试剂盒的扩增重复性好，精密度均≤2％。

技术领域

本发明属于病毒检测试剂盒技术领域，涉及实时荧光PCR检测试剂盒，特别是涉及一种同时检测单纯疱疹病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、JC病毒和EB病毒的试剂盒及其检测方法。

背景技术

单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)可分为I型和II型(HSV-I和HSV-II)。人是HSV唯一的自然宿主。I型单纯疱疹病主要是通过呼吸道、皮肤和粘膜密切接触传播，感染腰以上部位的皮肤粘膜和器官，如引起口唇粘膜、鼻前庭、眼结膜、咽喉部的炎症及疱疹。口和口周围发生的疱疹，99％是由I型疱疹病毒感染引起的。临床上又可分为原发型和复发型单纯疱疹。常见者如皮肤疱疹、疱疹性齿龈口腔炎、眼疱疹(急性结膜角膜炎、角膜溃疡)、湿疹样疱疹、疱疹性甲沟炎，重者可发展为全身性单纯疱疹、疱疹性直肠炎、急性脑炎、急性脑膜炎和神经根炎等。HSV-II型主要引起生殖器及腰以下皮肤疱疹。如果孕妇罹患原发性疱疹病毒感染，病毒就有可能在病毒血症期间通过胎盘感染胎儿而形成先天性感染。如果孕妇产道感染疱疹病毒(原发或复发感染)，则病毒可于分娩过程中感染新生儿而引起新生儿感染。无论是先天性感染或新生儿感染，预后都较差。原发感染后4～5天体内产生中和性抗体，但不能防止复发。原发病人可有发热，体温可高达39℃，病程7～9日；疱疹继发细菌感染则呈脓疱样或湿疹样，病程延长且愈后皮肤留瘢痕。复发性单纯疱疹，可有细胞免疫缺陷。

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)，是一种双链DNA病毒，KSHV是卡波氏肉瘤的病原体，卡波氏肉瘤是一种损坏外形并潜在致命的出血性肉瘤形式，其特征在于在皮肤上以深色斑或小结出现的多发性脉管肿瘤。在组织学水平上，其特征在于相对一致的纺锤形细胞的增殖，形成束和脉管裂缝。在炎症浸润中经常出现浆细胞，T细胞和单核细胞，胃肠损害处或相关的淋巴瘤处出血的最终结果可能是死亡。

JC病毒(JC virus，JCV)属乳多空病毒科多瘤病毒种人类多瘤病毒分支。1971年Pagett等首次从进行性多灶性白质脑病(progressivemultifocal leucoencephalopathy，PML)患者脑组织中分离出JC病毒。JC病毒在人群中广泛存在，主要潜伏在人的肾脏等组织内。JC病毒的感染发生在人的童年时期，呈持续亚临床潜伏感染状态，免疫健全状态下可终生无症状，属于无症状感染，但对于AIDS患者或服用免疫抑制药物的患者则可引发PML等系列疾病，PML是一种致死性中枢神经系统脱髓鞘疾病。近年来研究表明，JC病毒与多种人类肿瘤的发生相关，包括脑肿瘤、结直肠癌、胃癌、食道癌及B细胞淋巴系统肿瘤等。随着我国HIV/AIDS患者人数的逐年增加，JC病毒感染作为HIV/AIDS相关的机会感染也会逐年增多，以及肾移植等器官移植患者在施用免疫抑制药物后，JC病毒感染引发PML的概率增大，JC病毒所带来的危害也会更加突出。对JC病毒感染的检测包括检测血清中特异性的VP1抗体，对感染者的尿液、脑脊液、血液及病变组织进行JC病毒DNA检测，对活组织进行原位杂交及免疫组化检测等。由于JC病毒在人群中感染率很高，抗体检测并不能准确证明样品是否被活动性JC病毒感染。

EB病毒是疱疹病毒科病毒γ亚科中唯一能够引起人类感染的淋巴滤泡病毒，具有嗜B淋巴细胞的特性，能够在B淋巴细胞中建立起隐性感染，刺激细胞的增生与转化。可能与包括传染性单核细胞增多症、伯基特淋巴瘤、Burkits肉瘤、霍金奇病和鼻咽癌等在内的多种疾病有关。其中，80％的鼻咽癌病例发生在中国，在我国南方数省鼻咽癌的发病率和死亡率均占恶性肿瘤的第一位。EB病毒感染细胞后的裂解复制期产生壳抗原(VCA)IgA抗体，其在鼻咽癌中的阳性率达93％，具有极高的特异性。