[发明专利]比格犬血浆中达拉他韦的定量检测方法

说明书

本发明公开了一种比格犬血浆中达拉他韦的定量检测方法，属于药物检测技术领域。它包括如下步骤：1)配制达拉他韦系列工作溶液和达拉他韦‑d6内标工作溶液；2)待测比格犬血浆的预处理；3)配制系列校正标样及随行质控样品；4)测定待测比格犬血浆中达拉他韦浓度；其中，以达拉他韦和内标达拉他韦‑d6的色谱峰面积比为纵坐标，以比格犬空白血浆中达拉他韦的浓度为横坐标制作标准曲线，根据所述标准曲线计算出待测比格犬血浆中达拉他韦浓度。本发明还选择采用蛋白沉淀法对比格犬血浆样品进行处理，以电喷雾离子源作为电离技术，检测方法操作简便、灵敏度高、重现性好、选择性高、检测限低、分析时间短且适合比格犬血浆样本的高通量定量测定和临床前比格犬体内药代动力学研究。

技术领域

本发明涉及一种药物浓度的检测，属于药物检测技术领域，具体地涉及一种比格犬血浆中达拉他韦的定量检测方法。

背景技术

丙型肝炎是临床常见的传染性疾病之一，丙肝已被公认为是造成全球慢性肝脏疾病的主要原因，约有27％肝硬化、25％肝细胞癌是由丙肝引起的。丙肝已成为一种不容忽视的公共卫生问题，引起了全社会的广泛关注。

达拉他韦是一种选择性HCV非结构蛋白5a复制体抑制剂，对多个慢性丙型肝炎(HCV)基因型/亚型具有高度特异性，对宿主细胞的毒性较低。其由百时美施贵宝公司研发，2014年底获欧盟批准上市，联合其他药物，用于1、2、3、4基因型慢性丙型肝炎(HCV)成人感染者的治疗。并于2017年4月，中国国家食品药品监督管理总局批准盐酸达拉他韦片和阿舒瑞韦胶囊进口上市，用于成人慢性丙型肝炎的联合治疗，这是国内首次获批全口服抗丙型肝炎病毒的药物(DAA)。直接抗病毒药物(DAAs)的问世开创了丙型肝炎治疗新时代，使丙型肝炎的临床治愈成为可能。

盐酸达拉他韦(Daclatasvir Dihydrochloride)，化学名为((1S)-1-(((2S)-2-(5-(4’-(2-((2S)-1-((2S)-2-((甲氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰基)-2-吡咯烷基)-1H-咪唑-5-基)-4-联苯基)-1H-咪唑-2-基)-1-吡咯烷基)羰基)-2-甲基丙基)氨基甲酸甲酯二盐酸盐，其结构如下所示：

百时美施贵宝公司在专利CN101778841A中公开了一种盐酸达拉他韦的合成方法，并提到了其精制方法，中国专利CN109305962A公开了一种盐酸达拉他韦的精制方法。然而现有技术并未公开关于其在动物体内的药物检测方法，因此需要开发一种快速、灵敏、准确的分析方法来定量血浆中达拉他韦的浓度。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明公开了一种比格犬血浆中达拉他韦的定量检测方法。该检测方法不仅具备操作简便、灵敏度高、重现性好、选择性高、检测限低、分析时间短等优点，同时还适合对比格犬血浆样本的高通量定量测定。

为实现上述技术目的，本发明公开了一种比格犬血浆中达拉他韦的定量检测方法，它包括如下步骤：

1)配制达拉他韦系列工作溶液和达拉他韦-d6内标工作溶液；

2)待测比格犬血浆的预处理：向待测比格犬血浆中加入步骤1)所述达拉他韦-d6内标工作溶液及乙腈沉淀剂后，经过首次涡旋混合、离心分离、上清液加纯化水和二次涡旋混合后得处理后待测比格犬血浆；

3)配制系列校正标样及随行质控样品：将步骤1)所述达拉他韦系列工作溶液分为两份，分别加入比格犬空白血浆后，制备得到系列校正标样及随行质控样品；

4)测定待测比格犬血浆中达拉他韦浓度：取待测比格犬血浆、步骤3)的系列校正标样、随行质控样品按步骤2)的方式预处理后分别送入LC-MS/MS中进行测定，以达拉他韦和内标达拉他韦-d6的色谱峰面积比为纵坐标，以比格犬空白血浆中达拉他韦的浓度为横坐标制作标准曲线，根据所述标准曲线计算出待测比格犬血浆中达拉他韦浓度。