[发明专利]基于split-HRV 3C蛋白酶的蛋白相互作用检测方法

权利要求书

1.基于split-HRV 3C蛋白酶的蛋白相互作用检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、将超折叠绿色荧光蛋白sfGFP融合在HRV 3C蛋白酶底物序列LEVLFQ↓GP的N端,将SsrA降解标签融合在HRV 3C蛋白酶底物序列的C端，得到HRV 3C蛋白酶底物多肽sfGFP-LEVLFQGP-SsrA ；

步骤2、将sfGFP-LEVLFQGP-SsrA整合到大肠杆菌的染色体上，得到大肠杆菌重组菌株，HRV 3C 蛋白酶的切割位点为K82、L94或N107；

步骤3、将HRV 3C 蛋白酶拆分为N端HRV 3C蛋白酶结构域和C端HRV 3C蛋白酶结构域，将捕获蛋白融合到N端HRV 3C蛋白酶结构域，得到第一重组蛋白；将诱饵蛋白融合到C端HRV3C蛋白酶结构域，得到第二重组蛋白；

步骤4、将第一重组蛋白和第二重组蛋白转入大肠杆菌重组菌株中共表达，利用流式细胞仪检测重组大肠杆菌细胞的绿色荧光信号，若检测到有绿色荧光信号，则说明捕获蛋白和诱饵蛋白之间存在相互作用，若检测到没有绿色荧光信号，则说明捕获蛋白和诱饵蛋白之间不存在相互作用。

2.根据权利要求1所述的基于split-HRV 3C蛋白酶的蛋白相互作用检测方法，其特征在于，所述步骤2中HRV 3C 蛋白酶的切割位点为K82位点。

3.根据权利要求1所述的基于split-HRV 3C蛋白酶的蛋白相互作用检测方法，其特征在于，所述SsrA降解标签可被大肠杆菌内源性ClpXP降解复合物所识别，从而导致SsrA的N端融合的蛋白降解。

4.根据权利要求1所述的基于split-HRV 3C蛋白酶的蛋白相互作用检测方法，其特征在于，所述HRV 3C蛋白酶底物N端融合有sfGFP, C端融合有SsrA降解标签；所述HRV 3C蛋白酶底物多肽为sfGFP-LEVLFQGP-SsrA。

5.根据权利要求1-2中任一项所述的基于split-HRV 3C蛋白酶的蛋白相互作用检测方法，其特征在于，所述捕获蛋白和诱饵蛋白为待研究相互作用的目的蛋白对；所述捕获蛋白融合在N端HRV 3C蛋白酶结构域，诱饵蛋白融合在C端HRV 3C蛋白酶结构域。

6.根据权利要求1所述的基于split-HRV 3C蛋白酶的蛋白相互作用检测方法，其特征在于，所述捕获蛋白和诱饵蛋白发生相互作用时，N端和C端HRV 3C 蛋白酶融合形成具有完整功能的HRV 3C蛋白酶，对相应底物多肽切割识别，导致sfGFP信号的积累和细胞荧光强度的提升。

7.根据权利要求1所述的基于split-HRV 3C蛋白酶的蛋白相互作用检测方法，其特征在于，所述sfGFP信号可以通过流式细胞仪检测。