[发明专利]低温酯酶功能基因DcaE及其应用

说明书

本发明发现了一种具有低温酯酶功能的基因DcaE。本发明构建了含有该基因的重组载体，将其在原核宿主细胞大肠杆菌中表达。实验证明，所述基因在原核宿主细胞中表达后，低温下能催化酯类底物进行酯键水解反应，应用于各种酯类的降解。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种具有酯酶功能的基因。

背景技术

低温活性酯酶与中温酶和嗜热酶相比，在低温下具有更高的催化活性。该类酯酶不仅能在低温环境有效地提高工业生产效率，而且能以最小的能耗节约能源，因此低温酯酶在工业应用的各个方面都具有重要商业价值。

在微生物酯酶的活力测定中，目前本领域公认的通用模式底物为对硝基苯酯类化合物。如对硝基苯酚乙酸酯pNPA,对硝基苯酚丁酸脂pNPB,对硝基苯酚辛酸酯pNPC，对硝基苯酚月桂酸酯pNPL对硝基苯酚棕榈酸酯pNPP等。

在酯类的模式底物硝基苯酯类化合物中加入一种蛋白，通过测定生成的水解产物对硝基苯酚(pNP)含量来确定酯酶的酶活。如果对该模式底物有水解功能，则该蛋白被认为具有酯酶功能。

发明内容

本发明的目的是找到一种在生物催化中用于酯类化合物的降解反应的低温酯酶基因。

为了寻找适用于工业生产的酯酶，本发明筛选了基因DcaE(Deinococcus cold-adapted Esterase)，构建重组载体，进行表达纯化，首次发现DcaE基因可用于低温下酯类化合物的生物降解。具体研究工作如下：

1、获得含有DcaE基因的重组工程菌株

1)通过PCR从耐辐射异常球菌基因组扩增出DcaE基因，基因大小为939bp(序列见SEQ ID NO.1)，该基因编码312个氨基酸(序列见SEQ ID NO.2)，将其克隆于载体pET-32a上，该质粒含有能在大肠杆菌中都起作用的T7启动子，构建了含有T7启动子的完整DcaE基因的重组质粒pET32a-DcaE；

2)将导入DcaE基因的重组质粒pET32a-DcaE转入受体大肠杆菌BL21中，获得工程菌株BL21-pET32a-DcaE(详见实施例1)；

2、由基因DcaE编码的蛋白DcaE在大肠杆菌中的诱导表达与纯化

实验证实，DcaE基因在大肠杆菌中能够大量可溶性表达，并且通过镍柱亲和层析纯化到了纯品蛋白

3、蛋白DcaE降解对硝基苯酯类底物的检测实验

本发明采用了检测酯酶功能基因的通用公认模式底物对硝基苯酯类化合物，通过比色法测定了对硝基苯酯类化合物分解后生成对硝基苯酚的量，鉴定了酯酶DcaE的活力。

测定的酯类底物是：

对硝基苯酚乙酸酯pNPA(C2)

对硝基苯酚丁酸脂pNPB(C4)

对硝基苯酚辛酸酯pNPC(C8)

对硝基苯酚月桂酸酯pNPL(C12)。

实验结果表明，耐辐射异常球菌DcaE基因编码的DcaE蛋白能够降解上述对硝基苯酯类底物的酯键从而生成对硝基苯酚。

其中，对pNPC8的降解最佳，酶活可达32.14U/mg(见图2)。

上述实验证实，耐辐射异常球菌DcaE基因编码的蛋白DcaE能够降解酯类底物，具有酯酶功能。

4、DcaE蛋白在低温条件下(10℃至40℃之间)具有较高的稳定性和活性。详见实施例。