[发明专利]一种植物外植体安全低毒高效灭菌的方法

说明书

本发明公开了一种植物外植体安全低毒高效灭菌的方法，包括以下步骤：步骤1：将采来的外植体除去不用的部分后，进行清洗处理；步骤2：在超净工作台上操作，用质量浓度为70‑75％酒精溶液将外植体浸泡10‑30s，进行初步灭菌；步骤3：使用氯溴异氰尿酸+多菌灵组成的消毒剂对外植体进行二次灭菌；步骤4：使用无菌水对外植体进行清洗；本发明采用氯溴异氰尿酸+多菌灵对植物外植体进行灭菌处理，其既有良好的灭菌效果，又低毒环保。

技术领域

本发明涉及植物组织灭菌的技术领域，具体涉及一种植物外植体安全低毒高效灭菌的方法。

背景技术

由于取自外界的植物组织培养所用的外植体表面及植物组织内部都带有微生物，如果这些微生物不彻底灭除，一旦带入培养基，会造成培养基污染，特别是植物组织内部存在的病菌更是难以消除，是主要的污染源。

对于植物组织内部携带真菌和细菌已有相关研究证实，张建春等人对香蕉组织进行内生真菌分离、鉴定，共分离到9属494株内生真菌；周俊辉等也报道称很多植物组织内部存在内生细菌，且在植物组织培养中，由于材料内部(细胞内或细胞间)的内生细菌不能被一般的表面消毒方法所清除，随着材料带入培养过程，引起内生细菌污染，其危害性极大。

在某些植物初代培养或前几代的继代培养中存在的污染，并不形成明显的菌落而只在培养基内部形成“丝状物”，“晕状物”，不易被肉眼察觉，如不仔细观察很易被忽视(背光检查时较易被发现)，随着继代培养次数的增加，菌量逐渐累积，才在培养基上显现出来，导致培养失败。

同样在胡士敬等人的发明中，虽然清洗与灭菌工作同步开展，避免了自来水中或是外植体上冲洗下来的微生物沿着外植体的毛细管进入植物气管内部，在一定程度上也降低植物组织培养的污染率，但这种方法只是最大限度的降低了外植体消毒过程中外界病菌的入侵，组织内部的内生菌却并未除去，外植体在培养的过程中仍有较大的污染率。

目前已有可用于植物外植体消毒的灭菌消毒剂有酒精、升汞、次氯酸钠、漂白粉、过氧化氢、新洁尔灭等。

其中酒精是最常用的表面消毒剂，以70-75％酒精杀菌效果最好，因为95％或无水酒精会使菌体表面蛋白质快速脱水凝固，形成一层干燥膜，阻止了酒精的继续渗入，杀菌效果大大降低；另外酒精具有较强的穿透力，使菌体蛋白质变性，杀菌效果好，同时它还有较强的湿润作用，可排除材料上的空气，利于其他消毒剂的渗入；但酒精对植物材料杀伤作用也很大，浸泡时间过长，植物材料的生长将会受到影响，甚至被酒精杀死，使用时应严格控制时间；而且酒精不能彻底消毒，一般不单独使用，多与其他消毒剂配合使用。

氯化汞也是植物外植体表面灭菌最为常用的灭菌剂；它是一种无机汞剂，抑制细菌巯基酶活性，使细菌代谢发生障碍，汞离子可与菌体蛋白结合，使蛋白变性，从而杀死菌体，杀菌力极强，效力比酚大，但对芽孢、病毒无效；也是一种剧毒化合物，对植物组织有一定的毒害作用，无法长时间处理进行植物组织内部消毒，且在室温下具有轻微挥发性，有可能导致实验室工作人员发生汞中毒。

因此寻找一种替代氯化汞进行植物外植体表面消毒的灭菌剂，减少汞的使用量，对安全使用和环境保护具有重要意义。

次氯酸钠可释放出活性氯离子杀死菌体；其消毒能力很强，不宜残留，对环境无害；但次氯酸钠溶液碱性很强，对植物材料也有一定的破坏作用。

漂白粉的有效成分是次氯酸钙，消毒效果很好，对环境无害，但它易吸潮散失有效氯而失效。

过氧化氢消毒效果好，易清除，又不会损伤外植体，只能用于叶片的消毒，不能渗透到组织内部杀菌。

新洁尔灭，别名苯扎溴铵，是一种表面活性消毒剂，表面活性剂改变细菌胞浆膜通透性，使菌体胞浆物质外渗，阻碍其代谢而起到杀菌作用；对绝大多数植物外植体伤害很小，杀菌效果好，但对绿脓杆菌、抗酸杆菌和细菌芽孢无效。