[发明专利]与含酪氨酸磷酸化修饰肽具有亲和力的变体SH2结构域

说明书

本发明属于蛋白酪氨酸激酶(PTKs)的应用技术领域，涉及与含酪氨酸磷酸化修饰肽具有高亲和力的变体SH2结构域。本发明提供了一种与含酪氨酸磷酸化修饰肽具有高亲和力的变体SH2结构域，包含选自SEQ ID NOs:3、4、5或6的氨基酸序列。本发明将残基取代已被引入SH2结构域的pTyr‑结合区域，阐述了对含pTyr肽的结合亲和性增强的有利取代。不同的取代组合表现了对亲和性增强的不同程度的影响。这些变体SH2结构域在体外与含pTyr蛋白的结合分析中，表现出其强度远高于野生型SH2结构域。

技术领域

本发明属于蛋白酪氨酸激酶（PTKs）的应用技术领域，涉及与含酪氨酸磷酸化修饰肽具有高亲和力的变体SH2结构域，具体涉及使用该变体用于治疗蛋白酪氨酸激酶相关的失调的方法，例如免疫学的和肿瘤学的失调，涉及使用该变体用于诊断蛋白酪氨酸激酶相关的失调的方法，涉及使用该变体用于检测、追踪或监控细胞中的酪氨酸磷酸化事件的方法，涉及使用该变体用于富集或纯化含有磷酸酪氨酸的肽或蛋白的方法，以及涉及含有该变体的药物组合物。

背景技术

蛋白酪氨酸激酶及其底物在多种细胞进程中起重要作用，例如增殖、分化和凋亡。磷酸酪氨酸（还称为pTyr或pY）信号网中的异常激酶激活和伴随的改变是多种癌症的标志。细胞用来翻译pTyr介导的信号的主要机制依赖于特异性结合酪氨酸磷酸化蛋白的模块化蛋白结构域。Fyn同源区2（SH2）结构域是这些模块化结构域中最普遍的，并在PTK信号途径中起核心作用。不同的pTyr位点使用不同的含SH2结构域的蛋白，后者反过来激活不同的信号途径。

PTKs包括受体酪氨酸激酶，包括表皮生长因子激酶家族成员。在多种恶性和非恶性增殖性疾病中已经显示出增强的PTKs活性。此外，PTKs在调节免疫系统细胞中起作用是已知的。

PTKs是用于癌症治疗的重要药物靶点。目前的抗癌药主要基于小分子激酶抑制剂或人源化抗体。这些药物经常表现出对一组相关激酶的广谱特异性。

抑制PTK信号的替代想法是通过遮盖PTK底物的磷酸酪氨酸来阻断下游信号。虽然磷酸酪氨酸特异性抗体对含pTyr多肽具有高亲和性，但是它们不能在细胞内使用。

含SH2结构域的蛋白在PTK信号下游起作用，且为信号集合点。SH2结构域含有约100个氨基酸。当分离的SH2结构域在细胞中递送或表达时，其能够与结合pTyr位点的内生性信号蛋白竞争。

发明内容

本发明的目的在于增强SH2结构域与含pTyr肽的结合亲和性。本发明利用SH2结构域中已引入残基取代的pTyr-结合区域，阐述了对含pTyr肽的结合亲和性增强的有利取代。不同的取代组合表现了对亲和性增强的不同程度的影响，并且所产生的变体SH2结构域组（panel）显示了亲和性梯度。这些亲和性增强的变体在体外结合分析中和在哺乳动物细胞系中表现出比野生型对照SH2结构域更紧密的与含pTyr的蛋白的结合。因此，变体结构域在生理环境中和在体外条件下都起作用。

本发明是采用以下的技术方案实现的：

在本发明的一个实施方式中，变体SH2结构域包括在亲代SH2结构域的8个氨基酸位点的预定义区域中具有至少一个氨基酸取代的亲代SH2结构域，该取代增强了变体SH2结构域相对于亲代SH2结构域而言对含pTyr肽的亲和性。

在本发明的一个实施方式中，当所述亲代SH2结构域与SEQ ID NO:1对齐时，亲代SH2结构域的8个氨基酸的预定义的区域对应于SEQ ID NO:1的Lys19(位点1)、Glu41(位点2)、Thr42(位点3)、Thr43(位点4)、Ala46(位点5)、Ser48(位点6)、Lys63(位点7)和Lys66(位点8)。

本发明提供了一种与含酪氨酸磷酸化修饰肽具有高亲和力的变体SH2结构域，包含选自SEQ ID NOs: 3、4、5或6的氨基酸序列。

在本发明的变体SH2结构域的另一个实施方式中，亲代SH2结构域是真核的(eukaryotic)。